[发明专利]一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用

说明书

本发明公开了一种融合蛋白及其应用。具体为一种肿瘤微环境酸响应融合蛋白及其在肿瘤治疗中的应用；该融合蛋白从C端到N端依次包含：具有肿瘤微环境弱酸响应性pHLIP的氨基酸序列、间隔基和CCL21。所述融合蛋白以CCL21为靶点，重塑肿瘤微环境中肿瘤相关淋巴管至周围组织间的CCL21浓度梯度，抑制肿瘤淋巴转移。本发明的融合蛋白的活性域CCL21更接近天然CCL21功能，可以更好地锚定到肿瘤细胞表面，有效地发挥通过重塑肿瘤微环境治疗肿瘤的作用，对乳腺肿瘤或前列腺肿瘤的治疗，尤其是对三阴性乳腺肿瘤的治疗，效果更为显著。

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体涉及一种肿瘤微酸响应性融合蛋白及其应用。

背景技术

乳腺癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。在我国，乳腺癌的发病率为女性恶性肿瘤的第一位，其发病率和死亡率逐年上升。三阴性乳腺肿瘤(TNBC)占每年乳腺癌确诊病例的10-20％，恶性程度高，转移性强，一直是乳腺癌研究的热点和治疗的难点。由于不表达雌激素受体、孕激素受体和HER-2，TNBC患者无法从常规的内分泌治疗和抗HER-2治疗中获益。目前，TNBC的治疗手段有限，且缺乏针对性的治疗策略，与其他亚型的乳腺癌相比，TNBC患者预后较差，主要由于其更易复发转移。肿瘤转移，尤其是淋巴转移是TNBC患者治疗失败的主要原因，抑制淋巴转移对改善TNBC患者预后具有重要意义，也是许多科研工作者在基础医学和临床研究工作中亟待解决的难题。

刊载于药学学报Acta Pharmaceutica Sinica 2018,53(3):375-382《低pH插入肽研究概况》的论文，公开了细胞外微酸环境已成为肿瘤等疾病诊断和治疗的有效靶点。低pH插入肽(pH low insertion peptides,pHLIPs)是一种可以靶向细胞外微酸环境的多肽载体,这种载体可将负载物以低pH依赖方式选择性转运至病变细胞。借助化疗方法治疗癌症的最大问题是药物给健康组织带来的毒性,使用pHLIP将药物以低pH依赖方式靶向转运至癌细胞,在保证药物对癌细胞有杀伤效应的前提下大大减小了其对健康组织的毒性。pHLIPs家族具有非常广阔的应用前景,不仅可用于靶向酸性病变组织,还可通过改变氨基酸序列调节pHLIP性质,进而调节其药动学特性及靶向性。此外,pHLIP可用于研究新型药物递送系统:①单分子转运研究可适用于将极性药物传递到病变组织；②pHLIPs与脂质体或纳米粒的结合可促进细胞膜变形融合,有效运送药物至细胞质或细胞膜。

中国药学杂志2020年2月第55卷第4期刊载《低pH插入肽修饰的载siRNA脂质体的制备与体外评价》的论文，公开了核酸类(siRNA等)药物在疾病的治疗上具有高度特异性、安全和靶点多样性等独特优势。但其游离形式在体内容易被核酸酶(RNase)降解、半衰期短、转染效率低，这大大限制了其临床应用。该实验设计构建一种微酸环境敏感的脂质体载体，用于实现siRNA(小干扰RNA)的肿瘤组织水平、细胞水平甚至细胞器水平的高效定位递送。方法采用薄膜分散法，以二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)和胆甾醇半琥珀酸酯(CHEMS)为膜材制备空白脂质体；用两亲性材料SA-R8压缩siR-NA，再与空白脂质体孵育制备载siRNA脂质体；将端基功能化的磷脂(DSPE-PEG2000-MAL)与低pH插入肽(pHLIP)反应连接，再与载siRNA脂质体孵育融合，构建低pH插入肽修饰的载siRNA脂质体；借助动态光散射原理，流式细胞术和激光共聚焦技术，表征脂质体的粒径及分布，监测细胞摄取、胞内转运与分布特征。结果是制备的载siRNA脂质体平均粒径在150～190nm内；在pH6.5环境下siRNA的细胞摄取量显著高于pH7.4环境；并且siRNA能很好地定位在细胞质。结论是该载体显示出了较强的pH敏感性，在微酸环境下可以显著提高siRNA的肿瘤细胞摄取水平。