[发明专利]一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用

说明书

本发明公开了一种重组β‑1,4‑内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用，属于酶工程技术领域。该重组β‑1,4‑内切葡聚糖酶固定化细胞是通过重组β‑1,4‑内切葡聚糖酶菌株固定于海藻酸钠和钙盐形成的凝胶中制备得到的，该固定化细胞具有较好的稳定性，制备工艺合理，内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好，实现了β‑1,4‑内切葡聚糖酶的重复、高效利用。

技术领域

本发明涉及酶工程技术领域，特别是涉及一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用。

背景技术

在自然生态系统中，纤维素是含量最丰富的有机化合物，也是植物组织细胞中的主要成分，一般占植物干重的30％-50％。大量的秸秆、稻梗等含纤维素丰富的物质的利用率也很低，大多采用燃烧的方法来处理，这样就造成了环境污染，破坏了土壤的理化性质和丧失了有机质成分。充分利用纤维素资源，将其有效转化成可利用的资源，对于解决当前的能源危机、粮食短缺、环境污染等世界性难题都有着重大的意义。如果将纤维素以工业规模转化成葡萄糖的技术开发成功，那么纤维素资源便可成为人类食物、动物饲料、发酵工业原料以及能源的新来源。但目前有效利用纤维素生物质资源的主要障碍是纤维素酶的酶解效率十分低下，与淀粉酶相比相差2个数量级以上，进而导致纤维素酶解过程中纤维素酶的成本过高，约占纤维素糖化工艺的40％以上，从而严重阻碍了纤维素酶在纤维素糖化中的广泛应用。

纤维素酶是一类酶的总称，可以分为内切葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanase，EC3.2.1.4，即C1酶)、外切葡聚糖酶(1,4-β-D-glucan cellobilhydrolase或exo-1,4-β-D-glucannase，EC.3.2.1.91)和β-葡聚糖苷酶(β-1,4-glucosidase，BG，EC.3.2.1.21)。其中，内切葡聚糖酶是纤维素酶系中最重要的酶类，可以作用于纤维素分子内的无定形区，将长链纤维素分子水解成短链状，产生小分子纤维素，可以为外切酶提供大量的反应末端，同时还能水解小分子的纤维素寡糖。近年来，人们对纤维素酶的分子结构、功能性氨基酸和酶基因的克隆研究开展的比较多。相关研究显示，纤维素酶分子具有类似的结构，一般由球状的纤维素催化结构域(Catalyticdomains,CD)，纤维素结合结构域(Cellulose-BindingDomsins,CBD)和连接桥(Linker)三部分组成。

酶的固定化，是指利用一些载体材料将酶束缚或者限制于一定的区域内，酶仍然能进行其特有的催化反应，并且能被回收和重复使用的一类技术。而所谓的固定化酶，是指在一定的空间内，呈闭锁状态，并仍然能保留其催化活力，可以连续或重复利用的酶。固定化细胞技术与固定化酶类似，细胞被固定化以后，可以继续存活，保持全细胞催化特性，而且固定化细胞对环境具有较高的耐受性，催化活性重复使用效率也较高。另外，固定化细胞比固定化酶成本低，可以反复生长使用，容易与反应体系分离。

但目前为止，尚未有利用固定化细胞技术对重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株进行固定化的报道。

发明内容

本发明的目的是提供一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备与应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明所制备的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞具有较好的稳定性，制备工艺合理，内切酶活性高、温度耐受性和pH稳定性好，实现了β-1,4-内切葡聚糖酶的重复、高效利用。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞，重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株固定于海藻酸钠和钙盐形成的凝胶中。

进一步地，所述重组β-1,4-内切葡聚糖酶菌株为EG/BL21菌株；所述钙盐为CaCl₂。

本发明还提供一种所述的重组β-1,4-内切葡聚糖酶固定化细胞的制备方法，包括以下步骤：

(1)将EG/BL21菌株进行活化、培养，收集菌液；