[发明专利]一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法

说明书

本发明提供一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法，所述微流控芯片由含有微通道的PDMS层与玻璃片层粘合而成，所述微流控芯片包括：两个进样口，一个出样口，以及一个用于外泌体捕获的微室，所述微室中包含由若干水滴状微柱组成的阵列结构。所述方法包括：外泌体的分离富集和外泌体表面蛋白的分析。本发明操作简便易推广，有望在评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等方面提供一个有效的技术平台。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，更具体地涉及一种用于外泌体分离富集的微流控芯片，以及一种外泌体表面蛋白的分析方法。

背景技术

外泌体(Exosomes)在肿瘤细胞微环境的胞间通讯中发挥着特殊的作用。这些纳米尺度的膜囊泡粒径一般在30-150nm之间，表面携带大量与其来源和功能密切相关的蛋白质和脂质成分，腔内部包含有DNA、microRNA、mRNA和胞质蛋白，是细胞间交流和信号转导的一种载体。肿瘤细胞分泌的外泌体进入前哨淋巴结后发出分子信号，影响肿瘤细胞的招募、细胞外基质的沉积和血管的增生，为肿瘤的侵袭转移创造了有利的环境。血液中肿瘤来源的外泌体含量随着肿瘤的生长而增加、同时随着癌症的有效治愈而下降，它们在体液特别是血液中丰度高且稳定，能够灵敏的反应出肿瘤当前的实际状态。和研究的较为深入的循环肿瘤细胞(Circulating Tumor Cells，CTCs)相比，肿瘤细胞分泌外泌体的行为更为活跃，在血液中的含量≥10⁹个/毫升(远远大于CTCs的浓度1-10个/毫升)。由于血液中微乎其微的CTCs对检测技术的要求很高，需要消耗过量珍贵的临床样本，所以外泌体被认为是很多疾病“液体活检”的新一代生物标志物，特别适合一些当前技术水平下难以分离CTCs的癌症的早期诊断。肝癌早期没有典型症状，确诊时多属中晚期，且复发率高达60％。肝癌来源外泌体相关的分析有望为评估癌症进展、实时检测和预后评估、个体化治疗等提供快速的非手术指标。除此之外，分离出的肿瘤外泌体表面蛋白可进一步用于遗传和生物分析，为我们提供一个癌症特异性信息的宝库。

由于外泌体极小的粒径和较宽的粒径分布限制了其识别和定量的准确性和灵敏度，极易产生假阴性结果，外泌体检测技术通常需要初步分离富集和识别分析两个阶段。然而要想在众多尺寸大小接近的膜衍生亚细胞结构(例如脱落小体、凋亡小体、核外颗粒体等)中分离这些变化多样的纳米尺度外泌体囊泡同样存在诸多困难。目前富集体液和细胞培养液中外泌体的方法有超速离心法、分子排阻层析、沉淀法、表面蛋白标记亲和分离方法等。超速离心法是外泌体浓缩的最为经典的方法，它包括离心速度高达200000g的差速离心步骤，需要使用常规医学实验室不具备的昂贵仪器设备，操作繁琐耗时。这种方法不仅回收率较低(5–25％)，很难将外泌体同其他细胞外膜泡(Extracellular Vesicles，EVs)彻底分离开来，而且长时间超高速的离心会破坏外泌体的完整性，使其丧失大量蛋白和RNAs。在此基础上发展而来的蔗糖梯度离心法，利用不同浓度蔗糖溶液产生的梯度使外泌体在离心过程中沉降到相应的等密度区，从而获得较高纯度的抽提外泌体。然而这种方法的样品准备过程繁杂，在耗费大量时间的同时也提高了运行成本。基于分子排阻层析分离的商品化试剂盒，实现了外泌体的简便分离和纯化，但是它们往往需要漫长的过夜孵育步骤且价格昂贵，如用于细胞培养液中外泌体分离的ExoQuick^TM和Total Exosome Isolation^TM等产品。沉淀法是根据外泌体膜疏水的特性，使用疏水的化学物质(例如聚乙二醇，PEG)进行沉淀富集，可以实现低成本、高效快速的外泌体分离。但是生物样品中常共存有大量蛋白质，PEG沉淀的外泌体中不可避免地会存在蛋白质共沉淀，因此后续的清洗步骤对于外泌体蛋白质的可靠鉴定十分重要。