[发明专利]一种酿酒酵母载体及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种酵母载体的构建方法，其特征在于，包括步骤：

提供PGBKT7酵母双杂交载体；

将所述PGBKT7酵母双杂交载体经过酶切线性化之后与35S:HYG序列片段同源重组，得到PGBKT7-Hyg重组载体，所述35S:HYG序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；

将所述PGBKT7-Hyg重组载体经过酶切线性化之后与细菌质粒转化子相关元件序列同源重组，得到PGBKT7-Hyg-pVS重组载体；

将所述PGBKT7-Hyg-pVS重组载体经过酶切线性化之后与CEN6-ARSH4序列片段同源重组，得到PGBKT7-Hyg-pVS-CEN6-ARSH4重组载体，所述CEN6-ARSH4序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；

将所述PGBKT7-Hyg-pVS-CEN6-ARSH4重组载体经过酶切线性化之后与MCS序列片段同源重组，得到PGBKT7-Hyg-pVS-CEN6-ARSH4-MCS重组载体，即构建得到所述酿酒酵母，所述MCS序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.根据权利要求1所述酿酒酵母载体的构建方法，其特征在于，所述细菌质粒转化子相关元件序列包括PVS1 StaA序列、PVS1-RepA序列和PVS1 OriV序列，其中，所述PVS1 StaA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，所述PVS1-RepA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述PVS1OriV序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。

3.根据权利要求1所述酿酒酵母载体的构建方法，其特征在于，所述35S:HYG序列片段的制备包括步骤：

以pMDC83质粒为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示的下游引物进行PCR扩增，得到所述35S:HYG序列片段。

4.根据权利要求1所述酿酒酵母载体的构建方法，其特征在于，所述细菌质粒转化子相关元件序列的制备包括步骤：

以pMDC83质粒为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示的下游引物进行PCR扩增，得到所述细菌质粒转化子相关元件序列。

5.根据权利要求1所述酿酒酵母载体的构建方法，其特征在于，所述CEN6-ARSH4序列片段的制备包括步骤：

以酵母基因组为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示的下游引物进行PCR扩增，得到CEN6序列片段；

以酵母基因组为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.14所示的下游引物进行PCR扩增，得到ARSH4序列片段；

以所述CEN6序列片段和ARSH4序列片段的混合物为模板，采用核苷酸序列如SEQ IDNO.15所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示的下游引物进行PCR扩增，得到所述CEN6-ARSH4序列片段。

6.根据权利要求1所述酿酒酵母载体的构建方法，其特征在于，所述MCS序列片段的制备包括步骤：

以PEG101-MCS为模板，采用核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示的上游引物和核苷酸序列如SEQ ID NO.18所示的下游引物进行PCR扩增，得到所述MCS序列片段。

7.一种酿酒酵母载体，其特征在于，采用权利要求1-6任一所述酿酒酵母载体的构建方法制得。

8.一种酿酒酵母载体的应用，其特征在于，将权利要求7所述酿酒酵母载体用于人工合成植物染色体大片段的组装。

9.根据权利要求8所述酿酒酵母载体的应用，其特征在于，将所述酿酒酵母载体用于人工合成植物染色体大片段的组装包括步骤：

设计人工合成植物染色体相关片段ACEN2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示；

对所述人工合成植物染色体相关片段ACEN2进行Kpn I单酶切，得到ACEN2酶切产物；

对所述ACEN2酶切产物进行环化，得到ACEN2环化产物；

对所述ACEN2环化产物进行滚环扩增，得到ACEN2滚环扩增产物；

将所述酿酒酵母载体与ACEN2-linker序列片段同源重组，得到PACB-MCS-ACEN2-linker重组载体，所述ACEN2-linker序列片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示；

将所述PACB-MCS-ACEN2-linker重组载体与所述ACEN2滚环扩增产物转化酵母菌，在Trp缺陷培养基中培养后，获得表达PACB-MCS-ACEN2-linker和ACEN2滚环扩增产物的阳性重组酵母菌；

将所述阳性酵母菌基因组电击转化至大肠杆菌，进行PACB-MCS-ACEN2-linker和ACEN2滚环扩增产物的重组子的扩繁。