[发明专利]一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法

权利要求书

1.一种醇化烟叶表面微生物的分离和富集方法，所述方法包括：

(1)将醇化烟叶与磷酸缓冲液、石英砂和玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液；

(2)过滤步骤(1)获得的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于第一容器中，把微孔滤膜固定在所述第一容器的口，将所述第一容器倒置于第二容器中，即获得分离的微生物；

任选地，将步骤(2)中的微孔滤膜收集于第三容器中，加入钢珠和磷酸缓冲液，振荡、洗脱并离心，即获得富集的微生物。

2.权利要求1的方法，所述方法包括：

(1)将醇化烟叶置于无菌锥形瓶中，加入灭菌的磷酸缓冲液、无菌石英砂和玻璃珠，在低温摇床中振荡后，获得烟叶表面微生物洗脱液；

(2)使用纱布过滤步骤(1)中所得到的微生物洗脱液，将过滤后的洗脱液置于无菌细口塑料瓶中，把微孔滤膜固定在瓶口，将塑料瓶倒置于广口三角瓶中，过夜，微生物富集到滤膜上，即获得分离的微生物；

(3)将步骤(2)中滤膜收集于15mL无菌离心管中，加入无菌钢珠和灭菌的磷酸缓冲液，置于振荡器上，将滤膜上的微生物进行振荡洗脱后，离心，收集微生物沉淀，即获得富集的微生物。

3.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述醇化烟叶的质量为15-18g。

4.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的加入量为每15-18g醇化烟叶中加入300-400mL磷酸缓冲液。

5.权利要求1或2所述的方法，其中，在步骤(1)中，所述磷酸缓冲液的加入量为每15-18g醇化烟叶中加入350-380mL磷酸缓冲液。

6.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)中，醇化烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15-18:1-5:1-3。

7.权利要求1-5任一项所述的方法，其中，所述步骤(1)中，将15-18g醇化烟叶与350-380mL磷酸缓冲液、1-5g石英砂和1-3g玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液。

8.权利要求1-5任一项的方法，其中，所述步骤(1)中，醇化烟叶、石英砂、玻璃珠的质量比为15-18:2-4:1.5-2.5。

9.权利要求1-5任一项的方法，其中，在所述步骤(1)中，将15-18g醇化烟叶与350-380mL磷酸缓冲液、2-4g石英砂和1.5-2.5g玻璃珠混合，将该混合物低温振荡，获得烟叶表面微生物洗脱液。

10.权利要求1-9任一项所述的方法，其中，所述步骤(3)中，钢珠直径为3mm，加入量为3-4颗。