[发明专利]一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用

说明书

本发明属于植物原生质体培养技术领域，本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用。本发明以枣树的胚性悬浮细胞系为研究材料，通过酶解得到原生质体，纯化后得到了数量多且活性高的原生质体，并利用钙离子染料对原生质体内Ca²⁺浓度进行了探究。本发明方法简单、成本低，获得的原生质体数量多且活性高，为利用其研究Ca²⁺信号途径奠定了基础。

技术领域

本发明涉及植物原生质体培养技术领域，尤其涉及一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用。

背景技术

枣树(Ziziphus jujuba Mill.)是我国特色优势果树，在山沙碱旱贫困地区中发挥着重要作用。经过几十年的快速发展，枣产业进入了转型升级高质量发展新阶段，迫切需要培育综合性状优异的突破性新品种。枣树为多年生木本果树，利用转基因手段对其进行遗传改良十分困难，而利用枣原生质体进行遗传转化或细胞融合创建枣新种质可为枣树遗传育种开辟新的方向。

植物原生质体是指通过质壁分离，能够和细胞壁分开的那部分物质，包括细胞质、细胞膜和细胞核。原生质体不仅具有活细胞的性质，而且可以融合形成杂种细胞。原生质体没有了细胞壁障碍，可通过吞噬或融合作用直接摄取 DNA、质粒、病毒或细胞器等外源物质，它们是遗传转化的理想受体，在植物遗传改良等方面有着广阔的应用前景。

离体的原生质体具有细胞全能性，在适宜的无菌条件下可以生长、分化、再生成完整植株。可借助于原生质体方便地开展枣树基因的亚细胞定位、蛋白互作等研究。另外，利用原生质体融合进行体细胞杂交，可以打破枣树杂交育种困难等方面的问题。而获得高制备率且高活性的原生质体是利用原生质体的前提。目前，从高等植物中分离得到的原生质体大多数为草本植物，从木本植物分离得到原生质体非常困难。枣树原生质体制备研究的报道很少，且存在产量低、完整性低的严重问题，不能满足研究和利用的要求。

钙离子(Ca²⁺)作为一个信号离子，在植物生长发育和响应逆境胁迫信号转导中发挥重要的作用。钙离子信号向细胞质中的快速流入首先被钙离子感受器或钙受体蛋白感知，从而启动一系列蛋白质磷酸化反应并最终激活下游相关转录因子调节相关基因的表达来完成信号转导过程。而由于植物细胞壁的存在，给钙离子信号测定带来了挑战。目前常用的膜片钳、钙离子染色等技术都只能应用于原生质体，而钙离子信号在枣原生质体中的作用还未见有报告。

发明内容

为克服现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法及其应用。本发明以枣树的胚性悬浮细胞系为研究材料，通过酶解得到原生质体，纯化后得到了数量多且活性高的原生质体，利用钙离子染料对原生质体内Ca²⁺浓度进行了探究，为利用其进行钙离子信号检测等研究奠定了新的技术基础。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种枣树原生质体的高效分离方法，包括如下步骤：

(1)将枣树愈伤组织的细胞团置于细胞悬浮液体培养基中，进行黑暗培养，得到悬浮细胞；

(2)将继代培养三次后的悬浮细胞在黑暗条件下进行酶解，得到酶解细胞液；

(3)用细胞筛过滤所述酶解细胞液，对滤液进行离心，得到枣树原生质体。

优选的，步骤(1)中所述细胞悬浮液体培养基包括MS培养基4～5g/L，麦芽糖18～22g，琼脂5～6g，NAA0.4～0.6mg/L和TDZ 2～4mg/L，所述黑暗培养的转速为110～130r/min，所述黑暗培养的温度为24～26℃。

优选的，步骤(2)中所述酶解体系包括EME培养基、酶解液和悬浮细胞，所述EME培养基包括MS培养基4～5g/L，蔗糖235～245g/L和麦芽糖提取物 0.4～0.6g/L；