[发明专利]牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用

说明书

本发明提供了牛结核病血清学诊断标志物及其临床应用。本发明通过转录组测序分析、小鼠动物实验和临床试验获得了能够鉴别牛结核病阴、阳性的血清标志物：KLK12、MMP‑1和MMP‑9。本发明提供的牛结核病血清学诊断标志物与结核菌素皮试的诊断结果可达到100％一致，并且能够鉴别诊断潜伏感染牛和活动性结核病牛，不受其他分枝杆菌感染的影响，具有较强的特异性和较高的灵敏度。本申请的诊断标志物为牛结核病的诊断提供了新的靶点，可用于制备牛结核病的血清学诊断试剂盒，无需采集抗凝血和特异性抗原刺激，简化操作要求，提高诊断效率，有助于结核病牛的批量、快速检测和淘汰，为牛结核病的防控和净化提供了技术支撑。

技术领域

本发明属于兽医领域中的牛结核病防治领域，具体地，本申请提供了牛结核病血清学诊断标志物KLK12、MMP-1、MMP-9及其在制备牛结核病诊断试剂盒中的应用

背景技术

结核病由结核分枝杆菌复合群引起的慢性传染性疾病，结核分枝杆菌和牛分枝杆菌(Mycobacterium bovis，简称M.bovis)为主要致病菌，由牛分枝杆菌引起的牛结核病是一种重要的人畜共患病，也是危害畜牧业发展的重大传染病，而且严重威胁公共卫生和食品安全。研究显示牛分枝杆菌除感染牛外，还能感染不同种属的温血动物，包括灵长类、有袋、有蹄、食肉类、啮齿类和鳍脚类动物在内的50多种哺乳动物，还包括鸟类、北美洲乌鸦、石鸽等20多种禽类动物。此外，牛型分枝杆菌与人型结核分枝杆菌在基因水平上达到了99.95％的相似，人类食用未经巴氏消毒的奶制品或者与患病动物直接接触都有被感染的风险，有10％以上的结核病人(不同的国家和地区有不同的比例)是由牛分枝杆菌感染引起的。因此，对牛结核病的防控直接关系着畜牧业发展和人类健康。

副结核病(Paratuberculosis)又称为副结核性肠炎，是由副结核分枝杆菌(Mycobacterium avium subsp.paratuberculosis，MAP)引起的反刍动物的慢性消化道疾病，该病以顽固性腹泻、渐进性消瘦、肠黏膜增厚并形成皱襞为特征。世界动物卫生组织(OIE)将其列为必须通报的动物疫病，我国将其列为B类疫病。副结核病在世界范围内广泛流行，近年来我国发病率也呈上升趋势，给养殖业和乳制品行业造成了严重的经济损失。除此之外，副结核分枝杆菌的感染还可干扰结核病的诊断，造成结核病假阳性，影响结核病防控、清除以及进出境动物检疫。

结核菌素皮试(也称为芒图试验、PPD试验)是最早被用来检测牛结核病的方法，也是目前世界上应用最广泛的、世界动物卫生组织(OIE)推荐的牛结核病标准检测方法。但是，结核菌素皮试以牛结核菌素(PPD-B)作为刺激原，在生产过程需要培养大量牛分枝杆菌，对生产条件要求严苛，并且牛结核菌素与禽结核菌素(PPD-A)、环境分枝杆菌和卡介苗(BCG)存在共同抗原，在临床应用中容易导致假阳性结果的出现，也无法鉴别诊断潜伏感染牛和活动性结核病牛。血清学检测方法具有方便、快捷、高通量等优势，然而目前建立的牛结核病血清学诊断方法都未能达到所需的灵敏度和特异性，所以尚未被国际组织推荐使用。因此，筛选牛结核病的血清学诊断标志物，建立高敏感性、高特异性的牛结核病血清学检测方法，有助于结核病牛的批量快速检测和淘汰，为牛结核病的防控和净化提供技术支撑。

发明内容

为解决上述问题，本发明首先利用牛基因表达谱芯片研究了不同感染状态牛的巨噬细胞转录组变化，通过筛选找到了结核感染状态不同造成的差异基因，包括KLK12、SPARC、COL1A1、COL1A2、MMP1、MMP2、MMP3、MMP9、TIMP3等与细胞外基质重塑相关的蛋白网络，利用ELISA检测不同感染状态的牛血清筛选诊断标志物，从而提供一种牛结核病血清学诊断标志物，以筛选牛分枝杆菌感染牛，特别是鉴别诊断潜伏感染牛和活动性结核病牛。

一方面，本发明提供了牛结核病诊断相关标志物，其特征在于，所述牛结核病诊断相关标志物选自KLK12、MMP-1、MMP-9中的一种或多种。