[发明专利]应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法

权利要求书

1.应用于红细胞超分辨成像及单分子追踪的综合分析方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、样品的制备

采指尖血，加入等比例抗凝血剂及适宜浓度的细胞膜荧光染料染色，待染色完毕后，使用等渗溶液洗去多余染料，得到荧光染料标记的血红细胞样品。

S2、红细胞的固定

将荧光染色后的血红细胞样品注入到高通量微流控芯片中，芯片中红细胞固定腔室的高度不超过红细胞线度的一倍，红细胞被吸入红细胞固定腔室后被单层固定；

S3、基于单分子定位的超分辨成像

载有红细胞的微流控芯片置于超分辨显微镜上进行成像观察，高密度单分子信号叠加后得到红细胞的超分辨重构图；

S4、单分子追踪分析

低密度单分子信号叠加后进行单颗粒的追踪分析；

在超分辨成像中通过点扩散函数PSF获得的单分子定位信息，得到细胞的定位坐标可以直接应用于单分子追踪分析；

r²是单分子在Δt时间内运动的平方位移，计算如下：

r²(t，Δt)＝(x_t-x_t+Δt)²+(y_t-y_t+Δt)² (1)

其中：Δt是成像拍摄的曝光时间，t为该分子定位的时刻，x_t为t时刻的该分子的x坐标值，x_t+Δt为为t+Δt时刻的该分子的x坐标值；y_t为t时刻的该分子的y坐标值，y_t+Δt为为t+Δt时刻的该分子的y坐标值；

细胞膜表面单个分子的均方位移MSD，计算如下：

其中：N为该分子追踪轨迹中Δt时间间隔出现次数；

单条追踪轨迹的累计密度分布CDF，计算如下：

其中：D是单分子轨迹的扩散系数。

而对整个细胞进行扩散动力学分析，扩散系数概率密度PDF，计算如下：

其中，μ为平均数，σ为标准差；

根据对数正态分布，单细胞的平均扩散系数，计算如下：

如果细胞中包含两种扩散形式或两种扩散分布，使用双指数方程进行拟合：

其中：w是扩散系数为的组分比例，与分别为两种组分的扩散系数

红细胞表面的单分子运动瞬时速度，也间接的反映了细胞膜的流动性，计算如下：

其中，r(t,Δt)是单分子在Δt时间内运动的位移。