[发明专利]一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法

权利要求书

1.一种基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1)制备碱基上含氨基连接臂的核酸：在含有phi29DNA聚合酶的滚环扩增反应体系中掺入可配对的、碱基部分的5号位含炔丙氨基修饰的人工核苷酸，制备得到部分碱基上含氨基连接臂的核酸；

(2)制备非天然核酸水凝胶：步骤(1)所得核酸浓缩、退火，将退火产物与化学交联剂在磷酸盐缓冲液中混合，孵育，即获得所述的水凝胶。

2.根据权利要求1所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的化学交联剂为磺基双琥珀酰亚胺酯多聚乙二醇NHS-PEG_n-NHS，其中，PEG_n中的n为聚乙二醇中乙二醇单体的个数，所述n的取值范围为2～12，进一步为6。

3.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的浓缩通过30kDa的过滤膜在6000rpm离心30min实现；

步骤(2)中所述的退火的条件为95℃，5min，逐渐冷却至室温。

4.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(2)中所述的孵育体系中各物质的终浓度分别为：退火产物2～4μg/μL、化学交联剂2～4mmol/L；孵育的条件为35～40℃，10～14h；

步骤(2)中所述的磷酸盐缓冲液是pH 8.4～8.6的磷酸盐缓冲液。

5.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(1)中所述的掺入的方式是完全替代或部分替代天然核苷酸中的一种或多种，最终得到的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸含量为10％～40％；

步骤(1)中所述的核酸片段中碱基上含氨基连接臂的核酸为间隔分布，长度为1000～5000bp。

6.根据权利要求1或2所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

步骤(1)的具体操作如下：在phi29DNA聚合酶缓冲液加入模板和引物，退火结合；退火后加入dNTPs、牛血清蛋白和phi29DNA聚合酶，孵育。

7.根据权利要求6所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

所述的phi29DNA聚合酶缓冲液中各物质的浓度分别为：模板5～20nmol/L、引物5～20μmol/L、dNTPs各0.4～0.6mmol/L、牛血清蛋白0.02～0.03mg/mL、phi29DNA聚合酶0.2～0.3U/μL。

8.根据权利要求6所述的基于phi29DNA聚合酶滚环复制长链碱基修饰核酸活性制备水凝胶的方法，其特征在于：

所述的退火结合的条件为95℃，5min，逐渐冷却至室温后于冰上放置5min；所述的孵育的条件为27～32℃，10～14h。

9.一种非天然核酸水凝胶，其特征在于：通过权利要求1～8任一项所述的方法制备得到。

10.权利要求1～8任一项所述的非天然核酸水凝胶在生物医学领域中的应用。