[发明专利]一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法

说明书

本发明涉及一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法，具体指使用基因枪法将克隆出的β‑胡萝卜素酮化酶基因(bkt)，转入至莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)的叶绿体中，在含120mg/L壮观霉素固体培养基筛选得到转化子。随后经过PCR和基因组酶切Southern杂交分析，证明bkt基因通过同源重组定点整合到转化子的叶绿体基因组中。进一步通过RT‑PCR和RT‑PCR Southern杂交分析，最终证明bkt在衣藻转化子中得到表达，进而实现虾青素的简单、安全、便捷性生产。

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别涉及一种基于海藻基因工程技术的虾青素制备方法。

背景技术

雨生红球藻(Haematococcus pluvialis)是一种单细胞淡水绿藻，在环境胁迫条件下可以迅速诱导合成虾青素，其积累量可高达细胞干重的5％，是其它虾青素合成生物体积累量的一到多个数量级。雨生红球藻是目前首选的天然虾青素合成藻。虾青素是具有强抗氧化活性的类胡萝卜素，其抗氧化活性比其它类胡萝卜素高约15倍，比α-生育酚高600倍，被公认为是“超级维生素E”。这种超强的抗氧化能力赋予虾青素广泛的医用价值，如提高人体的免疫能力、抗肿瘤活性等。

莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii)是单细胞绿藻，具有培养简单、生长快速等优点。莱茵衣藻的叶绿体内具有虾青素合成的底物β-胡萝卜素。提取、纯化藻内积累的虾青素方便、成本低，并且衣藻可以封闭式培养，避免转基因生物安全性问题。β-胡萝卜素酮化酶和β-胡萝卜素羟化酶是将β-胡萝卜素转变成虾青素的两个关键酶。到目前为止，衣藻类胡萝卜素基因工程研究的报道甚少，更未见有可以便捷、安全、稳定地生产虾青素的制备方法。

发明内容

本发明的目的在于通过基因枪法将从雨生红球藻克隆出的β-胡萝卜素酮化酶基因(bkt)，转入至莱茵衣藻的叶绿体中，使得bkt基因在衣藻细胞中得到表达。为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

1.雨生红球藻与野生型衣藻均由深圳市华大海洋研究院实验室提供，雨生红球藻采用MCM培养基培养，野生型衣藻采用TAP培养基培养。

2.p64Dbkt衣藻叶绿体表达载体，含有衣藻叶绿体同源片段 clpP-trnL-petB及CRL基因并克隆有aptA-aagA-rbcL表达盒和aptA-bkt-rbcL表达盒，由本实验室构建。

3.根据NCBI上报道的雨生红球藻bkt的cDNA序列，设计bkt上下游引物(P1、P2)；根据aagA基因序列和衣藻叶绿体CRL基因序列设计PCR 引物(P3、P4)，鉴定转化子。引物由上海生工生物工程公司合成。