[发明专利]一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿斑病毒的方法

说明书

本发明提供了一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿斑病毒的方法，具体地，提供了基于CRISPR技术检测甘薯褪绿斑病毒或甘薯病害的方法，所述方法包括利用gRNA、Cas蛋白和单链核酸检测器进行检测的步骤；本发明通过对gRNA的筛选和优化，提高了检测效率，具有广阔的应用前景。

技术领域

本发明涉及核酸检测领域，涉及一种基于CRISPR技术检测甘薯褪绿斑病毒的方法，尤其涉及基于CRISPR技术检测甘薯褪绿斑病毒的方法、系统和试剂盒。

背景技术

甘薯褪绿斑病毒(Sweet potato chlorotic fleck virus，SPCFV)，属于线性病毒科(Flexiviridae)香石竹潜隐病毒属(Carlavirus)病毒，是侵染甘薯的主要病害之一，虽然甘薯褪绿斑病毒单独侵染甘薯时症状轻微，但是该病毒与甘薯褪绿矮化病毒共侵染甘薯时可形成协生病害，导致甘薯产生严重的症状。

甘薯褪绿斑病毒的检测方法主要有：酶联免疫吸附法、RT-PCR法。

本发明提供了一种新型的检测甘薯褪绿斑病毒的方法，该方法是基于CRISPR技术，尤其是基于V型Cas酶的trans活性，提供的一种特异性高、检测灵敏度高的快速检测方法。

发明内容

本发明提供了一种基于CRISPR技术进行甘薯褪绿斑病毒检测的方法、系统和试剂盒。

一方面，本发明提供了一种用于检测甘薯褪绿斑病毒的gRNA，所述gRNA包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列，所述靶核酸为来源于甘薯褪绿斑病毒的核酸。

本发明中，所述与CRISPR/CAS效应蛋白结合的区域又称为同向重复序列、骨架区或spacer序列，该区域与Cas蛋白相互作用，从而结合Cas蛋白。

在一个实施方式中，所述gRNA自5’端至3’端依次包括与Cas蛋白结合的区域和与靶核酸杂交的导向序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有17-30个碱基，并且与SEQID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，并且所述导向序列包含SEQ ID No.3-5任一所示的序列；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5任一所示的序列。

在优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列含有17-30个碱基，例如，17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30个碱基。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列包含SEQ ID No.3-5任一所示的序列，并且在SEQ ID No.3-5任一所示的序列的3’端还包括1-13个碱基(优选，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12个碱基)，并且，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交；优选的，所述导向序列包含SEQ ID No.3、4、5任一所示的序列。

在一个实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列与SEQ ID No.3-5任一所示的序列相比，在SEQ ID No.3-5任一所示的序列的3’端连续缺失1-5个碱基(例如，1、2、3、4、5个碱基)。

所述与SEQ ID No.1所示的序列或其反向互补序列杂交，是指上述导向序列与SEQID No.1或SEQ ID No.1的反向互补序列的连续的一段可以连续的互补配对。比如，所述与靶核酸杂交的导向序列含有30个碱基，则，导向序列的30个碱基需要与SEQ ID No.1或SEQID No.1的互补序列的连续30个碱基互补配对。

在更优选的实施方式中，所述与靶核酸杂交的导向序列如SEQ ID No.3-5任一所示。

在一个实施方式中，所述Cas蛋白选自V型Cas蛋白，例如，Cas12、Cas14家族蛋白或其突变体。