[发明专利]一种β-防御素2抗菌肽的制备方法在审

专利信息
申请号: 202111188606.9 申请日: 2021-10-12
公开(公告)号: CN114044817A 公开(公告)日: 2022-02-15
发明(设计)人: 沈永刚;肖攀;谢振亮;付坤;沈永良;程益明;胡桂香 申请(专利权)人: 杭州固拓生物科技有限公司
主分类号: C07K14/47 分类号: C07K14/47;C07K1/36;C07K1/34;C07K1/16;C07K1/06;C07K1/04
代理公司: 杭州山泰专利代理事务所(普通合伙) 33438 代理人: 张飞
地址: 310000 浙江省杭州市经*** 国省代码: 浙江;33
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摘要:
搜索关键词: 一种 防御 抗菌 制备 方法
【说明书】:

发明公开了一种β‑防御素2抗菌肽的制备方法,包括以下步骤:S1、选择Fmoc‑Pro‑2‑Chlorotrityl Chloride Resin树脂,溶胀后脱除Fmoc保护基;S2、按照β‑防御素2抗菌肽的序列,依次从C端到N端进行偶联直至最后一个氨基酸Fmoc‑Gly‑OH,脱除Fmoc保护基后得到β‑防御素2抗菌肽树脂肽。本发明中,使用Fmoc固相法、选择短二肽、短三肽作为反应原料进行偶联,降低了杂质的产生,并且采用先氧化形成一对二硫键形成较为稳定的结构后,再通过自然氧化形成剩余两对二硫键的思路,以达到粗品纯度高、收率高的目的,并具有可操作性强,降低“三废”排放的优势,可进行较大规模的生产,具有很强的理论指导价值与可观的经济实用价值,应用前景广泛。

技术领域

本发明涉及多肽合成技术领域,尤其涉及一种β-防御素2抗菌肽的制备方 法。

背景技术

人类在1980年发现了抗菌肽后,这类具有抗菌活性的多肽物质始终备受关 注,由于抗菌肽对细菌有着很强的杀伤效果,并且不容易产生抗药性,潜力巨大。 于是人们陆续从细菌、真菌、两栖类、昆虫、高等植物、哺乳动物、人类中发现 并分离获得各种抗菌肽,其中防御素就广泛分布在真菌、植物与动物中,β-防 御素2抗菌肽就是其中的一种。

β-防御素2抗菌肽是1991年在牛的气管黏膜上皮细胞中发现的,是由41 个氨基酸组成的多肽,并且包含三对二硫键,其序列为:

H-Gly-Ile-Gly-Asp-Pro-Val-Thr-Cys-Leu-Lys-Ser-Gly-Ala-Ile-Cys-His-Pro-Val-Phe-Cys-Pro-Arg-Arg-Tyr-Lys-Gln-Ile-Gly-Thr-Cys-Gly-Leu-Pro-Gly- Thr-Lys-Cys-Cys-Lys-Lys-Pro-OH,分子式为:C188H305N55O55S6,分子量为: 4328.23,其中Cys8与Cys37、Cys15与Cys30、Cys20与Cys38组成了三对二硫 键,因此β-防御素2抗菌肽具备较长的半衰期。

但同时由于结构式中具备三对二硫键,不可避免地增加了生产的难度,特别 是进行二硫键成环的操作中,氧化产生的杂质或者合成产生的杂质会产生不小的 影响,因此本发明是基于克服上述β-防御素2抗菌肽生产难度大、副反应多而 设计的一种新工艺。

发明内容

为了解决上述背景技术中所提到的技术问题,而提出的一种β-防御素2抗 菌肽的制备方法。

为了实现上述目的,本发明采用了如下技术方案:

一种β-防御素2抗菌肽的制备方法,包括以下步骤:

S1、选择Fmoc-Pro-2-Chlorotrityl Chloride Resin树脂,溶胀后脱除Fmoc 保护基;

S2、按照β-防御素2抗菌肽的序列,依次从C端到N端进行偶联直至最后 一个氨基酸Fmoc-Gly-OH,脱除Fmoc保护基后得到β-防御素2抗菌肽树脂肽, 其中,N端第8、15、30、37位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Trt)-OH,第20、38 位使用的氨基酸为Fmoc-Cys(Mmt)-OH,N端第1、2、3位使用的反应原料为 Fmoc-Gly-Ile-Gly-OH,N端第27、28位使用的反应原料为Fmoc-Ile-Gly-OH; Asp、Thr、Lys、Ser、His、Arg、Tyr、Gln的侧链保护基分别是OtBu、tBu、Boc、 tBu、Trt、Pbf、tBu、Trt,所有氨基酸α位氨基的保护基均为Fmoc;

S3、用TFA/DCM溶液与β-防御素2抗菌肽树脂反应,过滤得到带有侧链保 护基的β-防御素2抗菌肽,其中第20、38位的Cys侧链巯基裸露;

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