[发明专利]一种用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法

说明书

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及一种用于催化生产D‑对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法。本发明的工程菌的构建是将来自Agrobacterium tumefaciens的DHD基因和DCB基因分别构建在pBAD载体上，将构建成功的pBAD载体转化入大肠杆菌BL21(DE3)得到用于催化生产D‑对羟基苯甘氨酸的DHD工程菌与DCB工程菌。本发明的工程菌可以高密度培养，所得工程菌活性高，菌体量多，且不需进行纯化，只需进行简单的破碎，在48小时内就可以达到最高95％以上的产率，可以很好的解决目前工业上存在的问题。

技术领域

本发明涉及生物催化技术领域，特别涉及一种用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法。

背景技术

D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)是可以用于半合成青霉素羟氨苄青霉素、头孢类青霉素头孢氨苄、头孢哌酮等重要化合物的一种必需的医药中间体。但是D-HPG必须通过人工合成才能得到，合成方法大致分为两类：一类是采用化学方法合成得到外消旋体D,L-对羟基苯甘酸(D,L-HPG),再经拆分得到D-HPG。而经拆分得到D-HPG的方法,由于存在原料昂贵、产量低、反应时间长以及产生大量废弃物的缺点而逐渐被淘汰；另一类是生物酶催化选择性合成D-HPG，该法选择性高，污染小，但大规模工业化生产还有一定技术难度。因此，使用生物酶法制备D-HPG正在成为社会关注的热门领域。

生物酶法的原理如下面的反应化学式所示，D,L-对羟基苯海因(D,L-HPH)在D-海因酶(DHD)的作用下催化生成中间产物D-氨基甲酰-对羟基苯甘氨酸(D-CpHPG)，再经过D-氨甲酰水解酶(DCB)的作用脱去氨甲酰基，得到产物D-对羟基苯甘氨酸(D-HPG)。这种海因酶-氨甲酰水解酶的生物催化方法是目前商业化生产D-HPG的主要方法。

目前，已经有了很多关于生物酶法生产D-对羟基苯甘氨酸的研究报道。

有将两个酶分别构建再进行反应，但是对于两个酶分别构建并用于反应的方法，仍存在不足之处。目前对于两种酶分别的高密度发酵工艺的研究较少，使得工业化生产酶的用量存在着巨大缺口，并且如专利CN 112080532 A所述，所加入的是大量的纯化酶，且总共反应超过100小时，无疑不利于工业化的生产。

另一种方法是将两个酶构建在同一个载体共表达，近些年该方向研究发展迅速。在2007年，就有专利CN 101215533 B公布了双酶联用生产L-氨基酸的实例，而2008年，Yangqiu Liu等人进行了新的构建，优化了新的RBS区，提高了双酶共表达的效率；2019年，李法彬等人使用了枯草芽孢杆菌体系进行了表达，代替了传统的大肠杆菌表达体系。相较于两种酶分别构建，双酶共表达的优点在于一步法反应，更加方便快捷，但是由于两种酶的活性存在差异，共表达无法准确控制得到的两种酶的表达量，且两种性质不同的酶的最适发酵条件不同，如何获得大量的工业用酶存在着较大的限制，因此还只是存在于实验室阶段。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供了用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸的工程菌、高密度培养方法及催化生产方法，本发明的两种工程菌的发酵与一般摇瓶或基础培养基相比，产量显著提高，酶活有了显著提升，并且本发明是一锅法，反应简单，反应的时间也控制在了48小时，这无疑是一种显著的提高。且本发明重新构建的两种工程菌，所得工程菌活性高，菌体量多，且不需进行纯化，只需进行简单的破碎，按照固定的工艺条件，在48小时内就可以达到最高95％以上的产率，可以很好的解决目前工业上存在的问题。

一种用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸的工程菌，其特征在于，将来自Agrobacterium tumefaciens的DHD基因和DCB基因分别构建在pBAD载体上，将构建成功的pBAD载体转化入大肠杆菌得到用于催化生产D-对羟基苯甘氨酸的DHD工程菌与DCB工程菌。

优选的，所述大肠杆菌选自BL21(DE3)菌株。