[发明专利]利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法

权利要求书

1.一种利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于，包括如下步骤：将发育至3天的斑马鱼胚胎暴露于含有菊酯类杀虫剂的胚胎培养液中，采用半静态培养法，在特定温度、周期性明暗环境下培养，待斑马鱼胚胎发育至5天时，对斑马鱼胚胎的肝脏发育情况进行评价，

其中，所述斑马鱼胚胎为野生斑马鱼AB品系胚胎和转基因斑马鱼胚胎的组合。

2.根据权利要求1所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，含有菊酯类杀虫剂的胚胎培养液的配置方法如下：

1)采用二甲基亚砜作为溶剂将菊酯类杀虫剂配制成高浓度母液，于-20℃保存；

2)将配置好的母液用胚胎培养液稀释为不同浓度的工作液，溶液现配现用，保持二甲基亚砜的浓度小于千分之一；

3)将含有菊酯类杀虫剂的培养液与不含菊酯类杀虫剂的培养液注入6cm的培养皿中，培养液的体积控制在8～9mL。

3.根据权利要求2所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，稀释后菊酯类杀虫剂的浓度不低于10μg/L，

所述菊酯类杀虫剂包括天然除虫菊素、溴氰菊酯、氯氰菊酯或氯菊酯。

4.根据权利要求2所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，进行胚胎选择时，选取发育良好的，由斑马鱼繁殖发育至三天已孵化的胚胎进行暴露实验，每个培养皿中放置20个胚胎。

5.根据权利要求1所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，进行培养时，将培养容器置于恒温光控培养箱中，温度控制在28±1℃，光照与黑暗周期为14/10h，采取半静态培养法，每隔24h更换培养液，暴露时长为48h。

6.根据权利要求2所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，对斑马鱼胚胎的肝脏发育情况进行评价的方法包括：检测转基因斑马鱼胚胎肝脏面积和荧光强度；检测野生斑马鱼AB品系胚胎肝脏部位脂质油红染色情况、肝功能相关酶谷丙转氨酶及谷草转氨酶的数据结果并分析。

7.根据权利要求5所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，斑马鱼肝脏面积和荧光强度采集是通过荧光显微镜采集转基因斑马鱼仔鱼的2D图像，然后通过ImageJ软件勾勒出红色荧光的肝脏部分，计算红色荧光的面积及荧光强度。

8.根据权利要求5所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，检测野生斑马鱼AB品系胚胎肝脏部位脂质油红染色情况的方法包括如下步骤：

1)按质量体积比3:1000，取Oil Red O粉末充分溶解于体积分数为60％的丙二醇或PBS溶液中，配制成染色液，用滤纸过滤待用，该溶液现配现用；

2)收集暴露后的斑马鱼仔鱼，加入麻醉剂进行麻醉；

3)加入4％PFA，于4℃固定过夜后，PBS清洗3次，每次5分钟；

4)加入体积分数为60％的丙二醇或PBS溶液，室温孵育30分钟；

5)加入过滤后的新鲜Oil Red O染色液，室温孵育4小时；

6)PBS漂洗多次，每次20分钟，直至去除背景噪音信号

7)将胚胎置于载玻片上调整位置，在体式显微镜下观察并采集图像。

9.根据权利要求5所述的利用斑马鱼评价菊酯类杀虫剂肝脏发育毒性的方法，其特征在于：

其中，肝功能相关酶谷丙转氨酶及谷草转氨酶的样品采集与检测方法为：收集暴露后的斑马鱼仔鱼置于冰水中进行安乐死，每个样品加10倍体积PBS冰浴匀浆，3000g离心10分钟后，收集上清液，根据试剂盒说明对样品中谷丙转氨酶、谷草转氨酶活性进行检测。