[发明专利]一种用于检测星油藤溃疡病菌的特异性引物及方法

说明书

本发明提供一种用于星油藤溃疡病菌快速检测的特异性引物及方法，其中针Lasiodiplodia theobromae的特异性引物为LTF(5’‑GTGCACGCATGTCGTTTT‑3’)和LD(5’‑GAGCATTTTTCGCTAGTGG‑3’)，针对L.pseudotheobromae的特异性引物为LPF(5’‑CGAGAAGTTCGTGATTTCC‑3’)和LD(5’‑GAGCATTTTTCGCTAGTGG‑3’)。在病害发生早期采集疑似植物病样，采用CTAB法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物，进行PCR扩增，如果利用引物LTF/LD能够扩增出约200bp条带，则判断被L.theobromae侵染；如果利用LPF/LD扩增出约200bp条带，则判断为L.pseudotheobromae侵染。该发明为星油藤溃疡病的及早发现、及早治疗提供了可能，对该病害的有效防控具有重要意义。

技术领域

本发明涉及一种检测星油藤溃疡病菌的特异性引物及方法。

背景技术

星油藤(Plukenetia volubilis L.)是一种新兴的木本油料作物，其种子富含多不饱和脂肪酸、抗氧化剂以及蛋白质，具有较强的抗氧化性和药食保健功能，是理想的保健食用油和化妆品原料，具有非常大的开发和利用前景。然而，近年来星油藤病害发生严重，种植3年以上的植株发病率超过50％，最终导致整株死亡。溃疡病是危害星油藤茎部的一种重要的真菌病害，及早发现病害对其有效防控具有重要意义。前期研究发现引起该病害的病原菌主要为Lasiodiplodia theobromae和L.pseudotheobromae，本发明通过对几种常见病原真菌的TEF(translation elongation factor 1-alpha)序列进行比对，分别设计针对以上两种病原真菌的特异性引物，可在病害发生早期提取植物样品基因组DNA，利用PCR技术对该病害进行快速检测。该发明为病害的及早发现、及早治疗提供了可能。

发明内容

本发明提供一种用于星油藤溃疡病菌快速检测的特异性引物及技术，其中针对L.theobromae的特异性引物为LTF(5’-GTGCACGCATGTCGTTTT-3’)和LD(5’-GAGCATTTTTCGCTAGTGG-3’)，针对L.pseudotheobromae的引物为LPF(5’-CGAGAAGTTCGTGATTTCC-3’)和LD(5’-GAGCATTTTTCGCTAGTGG-3’)。

具体实施方式

在病害发生早期采集疑似植物病样，采用CTAB法提取基因组DNA，以基因组DNA为模板，利用上述引物，进行PCR扩增，扩增体系为：1×Rapid Taq Master Mix，上游引物和下游引物各200μM，基因组DNA 100ng，ddH₂O补至20μL。反应程序为95℃3min；95℃15s，52℃15s，72℃20s，35个循环；72℃7min。PCR结束后进行琼脂糖凝胶电泳，如果利用引物LTF/LD能够扩增出约200bp条带，则判断被L.theobromae侵染；如果利用LPF/LD扩增出约200bp条带，则判断被L.pseudotheobromae侵染。

本发明采用上述方案可以达到的效果是：利用特异性引物LTF/LD和LPF/LD进行PCR扩增，用于星油藤溃疡病早期快速检测，最低检测下限可达0.01ng，实现对病害进行早诊断、早治疗的目的。

附图说明

图1为几种病原真菌TEF序列比对图。其中A为上游引物模板序列，B为下游引物模板序列。