[发明专利]一种养生酒对幽门螺旋杆菌抑制作用有效性的验证方法

权利要求书

1.一种养生酒对幽门螺旋杆菌抑制作用有效性的验证方法，其特征在于：具体包括如下步骤，

(1)、准备充足的幽门螺杆菌国际标准菌株，准备实验小鼠70只，18～22g，雌雄各半；

(2)、分组：将所有小鼠随机分为7组，即空白对照组、模型对照组、阳性药物组、养生酒高剂量组、养生酒低剂量组及普通白酒高剂量组、普通白酒低剂量组，每组10只，再将实验小鼠先适应性喂养一周；

(3)、细菌培养：将幽门螺杆菌菌株在超净工作台中以每个平板100ul菌悬液的量划线接种于哥伦比亚血琼脂平板上，待菌液在培养基上吸干后，将培养基倒置放于厌氧培养袋中，而后迅速将微需氧产气包放入培养袋中并密封，置于37℃恒温培养箱中培养48～72h；待细菌长满平板，挑取典型菌落进行幽门螺杆菌菌株试纸鉴定，试纸颜色由黄变紫后，用生理盐水轻轻洗下菌落，测量菌液OD值；

(4)、动物造模：采用培养并收集的幽门螺杆菌菌株，菌悬液浓度用生理盐水调节为1×10⁹CFU/ml；造模前将小鼠禁食不禁水24h，除空白组外均先灌胃5％碳酸氢钠0.2ml/只，30min后再灌胃给予幽门螺杆菌菌液0.2ml/只/次，灌胃后再禁食禁水3h，之后正常摄食饮水；隔天感染一次，共8次；空白对照组给予等量生理盐水；

(5)、给药：造模结束后开始给药，给阳性药物组喂食阳性药物，养生酒高剂量组喂食49.4ml/kg的养生酒，养生酒低剂量组喂食24.7ml/kg的养生酒，普通白酒高剂量组喂食与养生酒同度数的普通白酒49.4ml/kg，普通白酒低剂量组喂食与养生酒同度数的普通白酒24.7ml/kg，其中均以0.2ml/10g/只灌胃给药，空白组及模型组灌胃给予等量生理盐水，每天一次，连续给药20天；给药期间各组自由饮水，正常进食；

(6)、模型检测：末次灌胃菌液2h后脱颈处死小鼠，快速完整取胃，观察胃部形态变化；将胃沿胃大弯剪开，展平于手术台上，小心刮取胃黏膜组织进行尿素酶试纸检测；

(7)、模型复制评价：若模型小鼠尿素酶试纸检测试纸由黄变紫，结果呈显阳性；空白组小鼠试纸检测呈阴性，空白小鼠胃红润光泽，整体完整无变形，；而模型组小鼠，胃外部呈现深紫色，表面皱缩、凹凸不平，出现明显病变；将胃沿胃大弯展开后，可见模型组出现点星状出血，可判断模型复制成功；

(8)、体征观察：实验过程中，各组小鼠均常规饲养，正常进食饮水，期间定期观察实验动物体征情况；

(9)、胃部大体形态学观察：末次给药24h后，采用颈椎脱臼处死小鼠，使用75％酒精腹部皮肤消毒，以组织剪自会阴至剑突剪开，离断隔肌至人工气胸，暴露腹腔并仔细分离胃周结缔组织，完整取出全胃标本；用生理盐水清洗胃标本，后用吸水纸轻轻吸干，观察胃部形态学变化；

(10)、胃窦部粘膜组织尿素酶检测：将胃沿胃大弯剪开，去除胃中残留食物等杂质，然后用生理盐水将胃组织反复冲洗干净，轻轻刮取胃窦部粘膜组织，用幽门螺杆菌试纸进行尿素酶检测，并进行结果判定；

(11)、胃组织病理学HE染色：沿胃大弯侧剪开胃标本，然后用生理盐水将胃组织反复冲洗干净；接着以大头针将冲洗干净的胃标本展平并固定于塑料泡沫板上，置于4％多聚甲醛溶液中固定24小时，然后胃组织HE染色，最后倍镜下观察胃黏膜炎症发生情况及病理变化；

(12)、肝组织病理学HE染色：将小鼠脱颈处死，打开腹腔，分离出肝脏；将肝脏放入4％多聚甲醛中固定，将固定好的肝脏制作成石蜡切片并进行形态学观察；

(13)、根据体征观察结果、胃部大体形态学观察结果、胃窦部粘膜组织尿素酶检测结果、胃组织病理学HE染色后观察结果和肝组织病理学HE染色后观察结果判断养生酒对幽门螺旋杆菌抑制作用有效性。

2.根据权利要求1所述的一种养生酒对幽门螺旋杆菌抑制作用有效性的验证方法，其特征在于：所述(5)中的阳性药物配方为奥美拉唑400nmol/kg、甲硝唑14.2mg/kg和克拉霉素7.15mg/kg。

3.根据权利要求1所述的一种养生酒对幽门螺旋杆菌抑制作用有效性的验证方法，其特征在于：所述(8)中的体征情况包括：精神状态、行为活动、毛发光泽度、是否出现活动异样及摄食、饮水情况，动物体重。