[发明专利]热稳定的逆转录酶突变体

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种热稳定的逆转录酶突变体。该逆转录酶突变体在野生型M‑MLV逆转录酶的基础上具有如下突变中的一种或多种：K15E、D235R、E441K和K445E；且具有显著提高的热稳定性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种热稳定的逆转录酶突变体。

背景技术

逆转录酶(EC 2.7.7.49)最初被发现为负责RNA病毒基因组复制的酶。它可以使用RNA或单链DNA(ssDNA)作为模板，同时具有RNase H活性和DNA聚合酶活性。莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT)，因为其高催化活性和保真度，是目前互补DNA(cDNA)合成中使用最广泛的逆转录酶。M-MLV逆转录酶活性蛋白是一个75KDa大小的单体，其具有两个活性位点，其中一个位于N端结构域中以进行DNA聚合，另一个位于C端域中以实现RNase H活性。

M-MLV逆转录酶是不耐热的，在没有模板引物(T/P)的情况下，在44℃下孵育10分钟，其活性下降至50％(T(50))。即使在模板和引物T/P(28μM)存在的情况下，在47℃孵育10分钟后，野生型M-MLV RT的活性也会下降到50％。

通过消除RNase H活性的同时保留完整的RNA指导的DNA聚合酶活性的方法，M-MLVRT的热稳定性得到了一定的提高。比如,RNase H-M-MLV RT(D524N)显示出更高的热稳定性，与M-MLV RT相比，其在50℃下的半衰期延长了4倍。通常，M-MLV RT的最佳应用温度在37℃，而RNase H-M-MLV RT建议在42℃下使用。

然而，分子生物学领域的应用仍然需要更进一步提高逆转录的反应温度以打开RNA二级结构，从而减少非特异性引物结合并通过降低错配的稳定性来提高M-MLV RT保真度。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种逆转录酶突变体，其氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的基础上具有如下突变中的一种或多种：

K15E、D235R、E441K和K445E。

上述逆转录酶突变体相对于未发生相应突变的M-MLV逆转录酶，具有显著提高的热稳定性，因而可以无需过多顾虑逆转录过程中的温度波动情况，并且能够减少非特异性引物结合并通过降低错配的稳定性来提高M-MLV RT保真度，具有更广阔的应用前景。

本发明还涉及分离的核酸，其编码如上所述的逆转录酶突变体，以及包含如上所述核酸的载体。

本发明还涉及宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。

本发明还涉及生产逆转录酶突变体的方法，包括：

a)培养如上所述的宿主细胞；

b)表达所述逆转录酶突变体；并

c)由所述宿主细胞分离所述逆转录酶突变体。

本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的逆转录酶突变体。

本发明还涉及组合物，其由如上所述的试剂盒中的各成分混合得到。

本发明还涉及用于逆转录一种或多种核酸分子的方法，包括：

i)使用如上所述的逆转录酶突变体与模板RNA接触，并且

ii)在足以生产与所述模板RNA互补的DNA的反应体系下保温。

本发明还涉及用于检测样品中RNA标记物的方法，包括：

i)使用如上所述的逆转录酶突变体与RNA标记物接触；