[发明专利]钾离子耐受的M-MLV逆转录酶突变体

说明书

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种钾离子耐受的M‑MLV逆转录酶突变体。该逆转录酶突变体在野生型M‑MLV逆转录酶的基础上具有如下突变中的一种或多种：E275K、E441K、E596K和K658E；且具有显著提高的对高浓度钾离子的耐受性。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体而言，涉及一种钾离子耐受的M-MLV逆转录酶突变体。

背景技术

逆转录酶(EC 2.7.7.49)最初被发现为负责RNA病毒基因组复制的酶。它可以使用RNA或单链DNA(ssDNA)作为模板，同时具有RNase H活性和DNA聚合酶活性。莫洛尼鼠白血病病毒逆转录酶(M-MLV RT)，因为其高催化活性和保真度，是目前互补DNA(cDNA)合成中使用最广泛的逆转录酶。M-MLV逆转录酶活性蛋白是一个75KDa大小的单体，其具有两个活性位点，其中一个位于N端结构域中以进行DNA聚合，另一个位于C端域中以实现RNase H活性。

目前，市售的M-MLV RT产品一般都提供含有KCl的第一链缓冲液。例如，来自Thermo Fisher Scientific和Promega的M-MLV RT带有5×第一链缓冲液，其中含有375mMKCl，这使得KCl的最终反应浓度达到75mM。此外，在样品处理或核酸提取过程中，许多抑制剂可能会被带入RNA样品中。比如，氯化钠和氯化钾是可能会残留在RNA样品中的常见盐类，它们会抑制随后的逆转录反应的过程。研究发现将KCl从15mM增加到75mM会增加逆转录酶-寡核苷酸解结合的表观速率常数(0.2–1.5s^-1)。此外，钾(K⁺)可以与DNA骨架上的磷酸基团(P-)结合并稳定双链体形成和引物退火。大量的K⁺和PCR和RT-PCR反应中常见的Mg²⁺成分结合起来会大大降低PCR和RT-PCR反应的特异性。目前的一种替代解决方案是基于铵离子(NH₄⁺)会破坏错配的引物-模板碱基配对之间的弱氢键，所以使用硫酸铵(NH₄)₂SO₄代替缓冲液中的KCl来增强特异性。然而，硫酸铵并非适用于所有不同的Taq聚合酶或逆转录酶。因此，耐受大量KCl的新M-MLV RT突变体不仅可以提高反应效率的同时也可以减少RT反应对复杂的RNA样品纯化处理步骤的依赖。

发明内容

本发明的目的在于提供一种逆转录酶突变体，其氨基酸序列在SEQ ID NO：1所示的莫洛尼鼠白血病病毒(M-MLV)逆转录酶的基础上具有如下突变中的一种或多种：

E275K、E441K、E596K和K658E。

上述逆转录酶突变体相对于未发生相应突变的M-MLV逆转录酶，具有显著提高的对高浓度钾离子的耐受性，因而可以无需过多顾虑RNA样品中残留的钾离子的影响，具有更广阔的应用前景。

本发明还涉及分离的核酸，其编码如上所述的逆转录酶突变体，以及包含如上所述核酸的载体。

本发明还涉及宿主细胞，其基因组中掺有如上所述的核酸，或被如上所述的载体所转化。

本发明还涉及生产逆转录酶突变体的方法，包括：

a)培养如上所述的宿主细胞；

b)表达所述逆转录酶突变体；并

c)由所述宿主细胞分离所述逆转录酶突变体。

本发明还涉及试剂盒，其包含如上所述的逆转录酶突变体。

本发明还涉及组合物，其由如上所述的试剂盒中的各成分混合得到。

本发明还涉及用于逆转录一种或多种核酸分子的方法，包括：

i)使用如上所述的逆转录酶突变体与模板RNA接触，并且