[发明专利]抗中介蝮GintexinA型PLA2毒素的杂交瘤细胞株、抗体及其应用

说明书

本发明公开了抗中介蝮GintexinA型PLA2毒素的杂交瘤细胞株、抗体及其应用。所公开的杂交瘤细胞株的保藏编号为CCTCC NO：C2019212。所公开的单克隆抗体具有特异性好、灵敏度高的特点。所公开的应用包括分离纯化、制备诊断探针或试剂盒、制备解毒药以及作为该毒素蛋白致毒机制研究的工具。

技术领域

本发明属于细胞工程领域，具体涉及一株能稳定分泌抗中介蝮(Gloydiusintermedius) GintexinA型PLA2毒素的杂交瘤细胞株、单克隆抗体及其应用。

背景技术

迄今为止，对蛇毒成分的组学研究共揭示出12个毒素家族：蛇毒磷脂酶A2(svPLA2)、蛇毒丝氨酸蛋白酶(svSP)、蛇毒金属蛋白酶(svMP)、三指毒素(3-FTx)，磷酸二酯酶(PDE)、磷脂酶B(PLB)、透明质酸酶(Hya)，L-氨基酸氧化酶(L-AO)、舒缓激肽增强肽(BPP-CNP)、蛇毒C-型凝集素样蛋白(CTLP)、富含半胱氨酸的分泌蛋白(CRISP)、生长因子(NGF)。其中， svPLA2家族表现出包括神经毒性在内的多种毒理学活性，三指毒素为心脏毒素，金属蛋白酶为出血毒素。

中国的毒蛇有六十多种，我国每年的蛇伤案例中以蝰科和眼镜蛇科毒蛇咬伤最为多见。眼镜蛇科蛇毒中的主要致死组分是PLA2和三指毒素(3-FTx)，蝰科蛇毒中的主要致死组分是PLA2或金属蛋白酶(svMP)，因此PLA2毒素家族在蛇毒中普遍存在。

中介蝮(Cloydius intermedius)属于蝰科蝮亚科(Crotalinae)亚洲蝮属(Cloydius)，是中国六种蝮蛇中毒性最大的一种，在中国主要分布于西北地区、华北地区和东北，国外主要分布于蒙古共和国及俄罗斯西伯利亚南部地区。已有研究结果表明：(1)该蛇毒中存在4 种类型的PLA2异构体(Gin-E6a、Gin-E6b、GintexinB、GintexinA)，其中前3个为Asp49- 型PLA2毒素(有磷脂酶酶A2活性)，属于阻断膈肌神经肌肉接头(NMJ)的突触前神经毒素， GintexinA为Asn-49型PLA2，无酶活性及神经毒性；(2)4种PLA2异构体中，GintexinB 和GintexinA表达水平最高(分别为33/78，38/78)，Gin-E6a和Gin-E6b表达丰度甚微(分别为6/78，1/78)；(3)起初以为GintexinA只是进化过程中一个因基因突变(氨基酸序列 Asp49突变为Asn-49)而失去神经毒性的退化异构体，然而后来的研究却得到一个有悖于常理的科学发现：在中介蝮的蛇毒中GintexinA和GintexinB形成了异二聚体Gintexin，其中的GintexinA作为“导向器”引导神经毒素异二聚体与膈神经NMJ突触的膜上受体结合，然后GintexinB才发挥神经毒性(阻断膈肌NMJ突触传递，使呼吸停止)，因此GintexinA 对GintexinB有增效作用，正因如此才导致中介蝮的蛇毒毒性成为中国六种蝮蛇中毒性最大的物种；(4)亚洲蝮属的其它5种毒蛇(短尾蝮，乌苏里蝮，蛇岛蝮，黑眉蝮，高原蝮)，因其蛇毒PLA2神经毒素中只有GintexinB的同源物(例如短尾蝮的神经毒素agkistrodotokin)，而缺乏GintexinA的同源物，因此他们的毒性都相对较低(六种蝮蛇的半致死剂量LD50数据：中介蝮0.38，短尾蝮0.525，乌苏里蝮0.70，蛇岛蝮0.735，高原蝮1.75，黑眉蝮2.064。单位：mg/kg体重)。

蛇伤的临床治疗目前最有效的方法是注射抗蛇毒血清，国内三甲医院里面用于蛇伤急救的抗蛇毒血清有5种，分别针对短尾蝮、五步蛇(尖吻蝮)、银环蛇、眼镜蛇、竹叶青蛇的咬伤急救。1982年，来自中国科学院的两个小组(上海生化所张景康课题组、成都生物所赵尔宓课题组)，以上海生物制品所生产的抗蝮蛇毒血清(以短尾蝮/江浙蝮的蛇毒为抗原，免疫马制备的抗血清，层析纯化得到)为材料，研究了抗蝮蛇毒血清(1mg冻干粉)对我国不同蝮蛇粗毒的中和效果(解毒作用)，结果如下表1所示。

表1抗短尾蝮蛇毒血清的中和作用