[发明专利]一种洗涤用碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用

说明书

本发明涉及碱性蛋白酶的蛋白质工程改造技术领域，提供一种洗涤用的碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。所述碱性蛋白酶突变体JD109（SEQ ID NO：2）的亲本蛋白酶为枯草芽孢杆菌PB92的碱性蛋白酶或者诺维信的碱性蛋白酶产品Savinase（SEQ ID NO：1）。所述碱性蛋白酶突变包含以下氨基酸的置换：N85S，S99G，S101A，V102I，Q239R，N242D，V262I，E265F，其中所述位置对应于氨基酸序列SEQ ID NO：1的多肽的氨基酸位置（根据SEQ ID NO：1进行的编号）。本发明提出的碱性蛋白酶突变体适合于在清洁或者洗涤剂组合物中使用。本发明提出的碱性蛋白酶突变体在碱性条件下的酶活比亲本蛋白酶Savinase有显著的提高，同时在不同洗涤剂中的稳定性也有所提高。

技术领域

本发明属于蛋白质工程改造技术领域，具体涉及一种洗涤用碱性蛋白酶突变体及其在液体洗涤剂中的应用。

背景技术

碱性蛋白酶（AlkalineProtease）属丝氨酸蛋白水解酶类，丝氨酸蛋白水解酶类是具有启动蛋白质肽键水解的活性位点丝氨酸的酶（EC3.4.21），主要有枯草杆菌蛋白酶类（EC3.4.21.62），这类酶属于MEROPS分类方案的S8肽酶家族，肽酶S8家族的成员在其氨基酸序列中具有酶催化活性位点为Asp、His和Ser的催化三联体。碱性蛋白酶在中性至碱性条件下水解蛋白质肽键、酯键和酰胺键，其最适作用pH一般为8~11。该酶种最早在猪的胰脏中发现。碱性蛋白酶广泛存在于微生物、植物和动物中。碱性蛋白酶主要应用领域包括洗涤剂、饲料、药物、皮革、大豆加工、酿酒厂、肉类嫩化、废物管理、摄影和诊断等轻工业领域。产碱性蛋白酶的微生物主要从盐碱湖、深海、沙地等碱性环境中分离得到。近几十年，随着新的碱性蛋白酶生产菌株的不断分离和纯化，碱性蛋白酶的研究有了很大的发展。迄今，芽孢杆菌(Bacillus)、放线菌(Actinomyces)以及真菌均有报道可以产碱性蛋白酶。目前用于工业化生产的菌种主要为地衣芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌等（TekinNetal.PolJ.Microbiol，2017，66(1):39-56）。碱性蛋白酶单独占全球酶市场的25%（MikkelsenMLetal.FoodandChemicalToxicology，2015:07-21）。其在酶工业中占有很大的比重，全球酶制剂市场中蛋白酶的销售额达到60%，而碱性蛋白酶就占35%。

碱性蛋白酶是最早应用于洗涤剂产品的酶制剂。污渍中血、奶、蛋、果汁、汗渍、咖啡等蛋白质大分子物质的水溶性不好，普通的表面活性剂和其他助洗剂都很难去除，碱性蛋白酶可将其分解成易溶于水的小分子肽键，然后再分解成氨基酸，从而很容易被洗去。洗涤剂产品中的碱性蛋白酶在没有稳定剂和抑制剂的情况下会自酶解而逐渐丧失酶活性。为提高洗涤剂中蛋白酶的稳定性，诺维信公司开发了高效的蛋白酶抑制剂4-FPBA（4-formyl-phenyl-boronicacid）用于稳定洗涤剂碱性蛋白酶产品，随后又致力于开发以肽醛为基础的抑制剂。