[发明专利]一种猪伪狂犬病病毒基因缺失株、疫苗组合物及其制备方法和应用

权利要求书

1.一株猪伪狂犬病毒(pseudorabies virus)变异强毒株，命名为PRV GX-2017，保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其菌种保藏编号为CGMCC No.22110。

2.一株猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株的基因缺失毒株，其特征在于所述的毒株是在权利要求1所述的猪伪狂犬病病毒变异强毒株PRV GX-2017的基础上，通过基因工程方法，将PRV GX-2017基因组中TK基因部分序列、gI基因的部分序列、US2基因的部分序列、gE基因的全部序列和US9基因的全部序列缺失，获得所述的猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株的基因缺失毒株；缺失的基因序列为：PRV GX-2017变异株基因组中TK基因的CDS区的第303位碱基至第908位碱基之间的DNA序列，以及gI基因CDS区的第268位碱基至US2基因CDS区的第284位碱基之间的DNA序列；

所述TK基因的序列如序列表中序列1所示；所述gI基因的序列如序列表中序列2所示；所述gE基因的序列如序列表中序列3所示；所述US9基因的序列如序列表中序列4所示；所述US2基因的序列如序列表中序列5所示。

3.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株的构建方法，其特征在于，该毒株的构建步骤为：

(1)gI-US2转移质粒的构建，以pUC载体为骨架载体，构建转移载体pUC-IES和pUC-IES-EGFP：在pUC载体中插入猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株基因组中gI基因缺失位点之前的部分序列作为左同源臂、US2基因缺失位点之后的部分序列作为右同源臂，得到转移载体pUC-IES；左右同源臂间插入EGFP基因表达框，得到pUC-IES-EGFP；

(2)TK转移质粒的构建，以pUC载体为骨架载体，构建转移载体pUC-TK-EGFP：在pUC载体中插入猪伪狂犬病病毒变异株PRV GX-2017株基因组中TK基因缺失5′位点之前的部分序列作为左同源臂、TK基因缺失3′位点之后的部分序列作为右同源臂，得到转移载体pUC-TK；左右同源臂间插入EGFP基因表达框，得到pUC-TK-EGFP；

(3)缺失gI-US2基因病毒的构建：转移载体pUC-IES-EGFP转染经亲本GX-2017病毒感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP；然后转移载体pUC-IES转染经缺失病毒PRV GX-ΔIES-EGFP感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔIES；

(4)缺失TK基因病毒的构建，转移载体pUC-TK-EGFP转染经缺失病毒PRV GX-ΔIES感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得表达绿色荧光蛋白的缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP，然后将转移载体pUC-TK转染经缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES-EGFP感染的Vero细胞，通过蚀斑筛选，获得GX-2017变异株缺失病毒PRV GX-ΔTK/IES；

所述步骤(1)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列6，所述右同源臂的序列为序列表中序列7；所述步骤(2)中，所述左同源臂的序列为序列表中序列8，所述右同源臂的序列为序列表中序列9。

4.一种疫苗组合物，其特征在于，由权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株和药学上可接受的佐剂组成。

5.权利要求2所述的猪伪狂犬病病毒变异株GX-2017株的基因缺失毒株在制备预防猪伪狂犬病疫苗中的应用。