[发明专利]一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，试剂盒和检测方法

说明书

本发明公开了一种检测罗湖病毒的荧光定量RT‑PCR引物对和探针，试剂盒和检测方法。所述引物对序列如SEQ ID NO:1和2所示，探针序列如SEQ ID NO:3所示。采用本发明要保护的引物探针序列的RT‑qPCR方法灵敏度数据明确，灵敏度可达到2.5×10supgt;‑8/supgt;ng/μL，且特异性好、重复性高。

技术领域

本发明涉及检测领域，尤其涉及一种检测罗湖病毒的荧光定量RT-PCR引物对和探针，试剂盒和检测方法。

背景技术

罗非鱼是很多发展中国家的主要食用蛋白质来源，也是许多渔民和养殖者的重要经济来源。罗非鱼养殖已成为保障全球粮食安全和满足人类营养需求的重要产业。

2009年以来，以色列、厄瓜多尔、埃及、泰国、哥伦比亚等国相继暴发养殖和野生罗非鱼大量死亡事件。直到2014年，才发现其致病病原是新型RNA病毒——罗湖病毒。罗湖病毒是2012年由美国科学家首次发现的危害罗非鱼的一种病毒，它是一种新型的RNA病毒，由10个独特的基因片段组成，直径55-75nm，目前仍未确定其分类地位，极有可能是正粘病毒科的一种新型病毒，与熟知的流感病毒同属一科。罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适温度25℃，所以每年的5-10月份均可能导致发病。感染罗湖病毒的病鱼常见症状为：体色发黑，体表有溃烂，眼睛有明显的病变，发病前期晶状体浑浊，后期晶状体破裂发炎，眼睛内容物浓缩，失去正常视觉功能。2018年Saengchan Senapin等，从无明显临床症状、无死亡的成年罗非鱼和鱼苗中检测出罗湖病毒，提示罗湖病毒可能像ISAV一样存在着变异株。

至今尚不清楚TiLV(罗湖病毒)的最初来源，野生或养殖的受TiLV感染的鱼群是目前已知的唯一传染源。有证据表明，病鱼的眼睛、大脑和肝脏常常含有高浓度的病毒，其肌肉组织也可能存在病毒。因此，发病死亡的罗非鱼可能是重要的病毒污染源。罗湖病毒是否会通过非罗非鱼物种和其它有机体(如食鱼鸟类和哺乳动物)携带，通过冷冻罗非鱼产品进行传播，目前尚不确定，但粮农组织指出，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁。

虽然该病原体不会引起公共卫生问题，但可以导致受感染种群大量死亡，感染的鱼因抵抗力变差感染其他病原菌，倘若人生食也有被其他病菌感染的风险。

目前，还未将TiLV列入检疫名录，也无相应的检测方法。因此，了解TiLV的流行病学和诊断技术，对预防和控制这种外来病具有重要意义。

国外已经在病毒的细胞培养、组织病理学、RT-PCR，nested RT-PCR,semi-nestedRT-PCR,SYBR quantitative RT-PCR、原位杂交等检测技术方面进行了研究，并建立了相应的检测方法。因为分子生物学方法具有快速、灵敏、简便的特点，大多数国家都采用其对TiLV进行监测和诊断，在检测和诊断时，也大多采用片段3基因，片段3编码假设蛋白。