[发明专利]用于使用多个引导RNA来破坏免疫耐受性的方法

权利要求书

1.一种产生针对目标外来抗原的抗原结合蛋白的方法，其包括：

(a)制备对目标外来抗原的耐受性降低的经遗传修饰的小鼠，其包括：

(i)向一群小鼠单细胞期胚胎或一群小鼠胚胎干(ES)细胞中引入：

(I)Cas9蛋白或编码所述Cas9蛋白的核酸；

(II)杂交至靶基因组基因座内的第一引导RNA识别序列的第一引导RNA或编码所述第一引导RNA的DNA，其中所述靶基因组基因座包含编码与所述目标外来抗原同源或共有目标表位的自身抗原的基因的全部或一部分；和

(III)杂交至所述靶基因组基因座内的第二引导RNA识别序列的第二引导RNA或编码所述第二引导RNA的DNA,

其中所述小鼠单细胞阶段胚胎或所述小鼠ES细胞来自包含BALB/c品系的小鼠品系或品系组合；

(ii)从所述一群小鼠单细胞期胚胎或所述一群小鼠ES细胞中筛选经修饰的小鼠单细胞期胚胎或经修饰的小鼠ES细胞，其中在一对相应第一染色体和第二染色体中所述靶基因组基因座被修饰以产生具有双等位基因修饰的所述经修饰的小鼠单细胞期胚胎或所述经修饰的小鼠ES细胞，其中所述双等位基因修饰包括编码自身抗原的基因的全部或部分的双等位基因缺失，以及其中所述自身抗原的表达被消除；和

(iii)从所述经修饰的小鼠单细胞期胚胎或无需额外交配步骤的所述经修饰的小鼠ES细胞产生经遗传修饰的F0代小鼠，其中在所述经遗传修饰的F0代小鼠中的所述一对相应第一染色体和第二染色体中所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除；

(b)用所述目标外来抗原使在步骤(a)中产生的所述经遗传修饰的F0代小鼠免疫；和

(c)在足以引发对所述目标外来抗原的免疫应答的条件下维持所述经遗传修饰的F0代小鼠，其中所述经遗传修饰的F0代小鼠产生针对所述目标外来抗原的抗原结合蛋白。

2.如权利要求1所述的方法，其中所述Cas9蛋白具有双链断裂诱导活性，并且其中所述引导RNA在所述靶基因组基因座内的不同位点处产生成对双链断裂。

3.如权利要求1或2所述的方法，其中：

(I)步骤(a)(i)中的所述细胞或胚胎是所述小鼠ES细胞，并且在步骤(a)(iii)中产生所述经遗传修饰的F0代小鼠包括将所述经修饰的小鼠ES细胞引入宿主胚胎中，和将所述宿主胚胎植入代孕母体中以产生所述经遗传修饰的F0代小鼠，其中所述一对相应第一染色体和第二染色体中的所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除；或

(II)步骤(a)(i)中的所述细胞或胚胎是所述小鼠单细胞期胚胎，并且在步骤(a)(iii)中产生所述经遗传修饰的F0代小鼠包括将所述经修饰的小鼠单细胞期胚胎植入代孕母体中以产生所述经遗传修饰的F0代小鼠，其中所述一对相应第一染色体和第二染色体中的所述靶基因组基因座被修饰以使所述自身抗原的表达被消除。

4.如权利要求1或2所述的方法，其进一步包括：

(d)(i)从分离自经免疫的经遗传修饰F0代小鼠的B细胞制备杂交瘤；或

(ii)从所述经免疫的经遗传修饰F0代小鼠获得编码针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白的免疫球蛋白重链可变结构域的第一核酸序列和/或编码针对所述目标外来抗原的所述抗原结合蛋白的免疫球蛋白轻链可变结构域的第二核酸序列。

5.如权利要求4所述的方法，其中所述第一核酸序列和/或所述第二核酸序列从所述经遗传修饰的F0代小鼠的淋巴细胞或从由所述淋巴细胞产生的杂交瘤获得。

6.如权利要求4所述的方法，其中所述经遗传修饰的F0代小鼠包含人源化免疫球蛋白基因座，并且其中所述第一核酸序列编码人免疫球蛋白重链可变结构域，并且所述第二核酸序列编码人免疫球蛋白轻链可变结构域。