[发明专利]重组工程菌及其用于制备D-泛解酸的方法

权利要求书

1.一种重组工程菌在制备D-泛解酸中的应用，具体为：第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三，将菌体一、菌体二、菌体三用于制备D-泛解酸；

所述第一重组工程菌表达L-氨基酸脱氨酶，所述L-氨基酸脱氨酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述第二重组工程菌表达醛缩酶，所述醛缩酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述第三重组工程菌表达甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶，所述甲酸脱氢酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述酮泛解酸还原酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其中，所述诱导表达包括下述步骤：

S-1：将重组工程菌按照1-5%接种量接种于LB培养基中，于30-40℃、50-500rpm条件下培养6-12h，获得种子液；

S-2：将种子液按照1-10%的接种量接种于发酵培养基中，30-40℃、pH 6.0-8.0下培养至发酵液OD值为0.5-2，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.5-1mM/L，30℃下培养12-24h，收集菌体，于-20℃下保存。

3.根据权利要求2所述的应用，其中，所述LB培养基的组成包括：卡那霉素50 mg/L，胰蛋白胨10g/，氯化钠10g/L，酵母粉5g/L。

4.根据权利要求2所述的应用，其中，所述发酵培养基的组成包括：七水硫酸镁2g/L、磷酸二氢钾7g/L、一水柠檬酸2g/L、硫酸铵3g/L、酵母粉1g/L、葡萄糖6g/L。

5.根据权利要求2所述的应用，其中，培养温度为30-37℃。

6.根据权利要求2所述的应用，其中，转速为100-400rpm。

7.根据权利要求2所述的应用，其中，转速为200-300rpm。

8.根据权利要求2所述的应用，其中，37℃、pH7.0下培养至发酵液OD值为0.6-1。

9.根据权利要求2所述的应用，其中，加入异丙基硫代半乳糖苷至其终浓度为0.6-0.8mM/L。

10.一种D-泛解酸的制备方法，具体包括如下步骤：将菌体一、菌体二、菌体三，以及缬氨酸、甲醛、甲酸铵混合，在30-40℃、pH为4-7条件下反应10-60h，制得D-泛解酸；

其中，第一重组工程菌经过诱导表达后得到菌体一，第二重组工程菌经过诱导表达后得到菌体二，第三重组工程菌经过诱导表达后得到菌体三；

所述第一重组工程菌表达L-氨基酸脱氨酶，所述L-氨基酸脱氨酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示；

所述第二重组工程菌表达醛缩酶，所述醛缩酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

所述第三重组工程菌表达甲酸脱氢酶和酮泛解酸还原酶，所述甲酸脱氢酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，所述酮泛解酸还原酶编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示。

11.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述第一重组工程菌含有L-氨基酸脱氨酶编码基因，所述L-氨基酸脱氨酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

12.根据权利要求10所述的制备方法，其中，反应体系菌体一的OD值为5-15。

13.根据权利要求10所述的制备方法，其中，所述第二重组工程菌含有醛缩酶编码基因，所述醛缩酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

14.根据权利要求10所述的制备方法，其中，反应体系菌体二的OD值为5-15。