[发明专利]一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法

说明书

本发明公开了一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法，包括所述特异性引物5’CACCACAGCAGTTGCCT3’和5’TCATTTGCTTGCTTCTTGACTG3’，所述探针为5’CCTGTCGCAGTGGCATCTCT3’。本发明设计中国被毛孢菌特异性引物和探针，优选后建立各样品实时荧光PCR鉴别方法，从分子水平解决了发酵虫草类药材的鉴别难题。

技术领域

本发明属于菌种鉴定技术领域，尤其涉及一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法。

背景技术

冬虫夏草作为一种传统的名贵中药材在中国已有上千年的历史，主产于青藏高原及其横断山区，具有补肺益肾、止血化痰、止咳定喘之功效，与人参、鹿茸共称为“中华三宝”。

由于天然冬虫夏草资源日益匮乏，且人工养殖冬虫夏草难以在市场中普及，目前对发酵虫草制剂的相关研究大多集中于产品的化学成分、药理作用等方面，对虫草发酵类产品的菌种及其菌株专一性的研究较少。该类产品的原料是发酵菌粉，发酵菌粉是由从冬虫夏草中提取分离的菌种经深层发酵培养而来，不同菌种发酵成不同菌粉，从而生产出不同发酵虫草制剂。因此提取分离的菌种是源头，其纯度如何，直接影响发酵虫草制剂的质量。而在菌种传代发酵培育过程中，如何保证该菌种的菌株在生产周期内的稳定而不发生菌株变异，是保证产品质量的根本，这些目前尚未见国内外相关文献报道。

中国被毛孢菌是百令胶囊或百令片的原料-发酵冬虫夏草菌粉的菌种来源。发酵冬虫夏草菌粉是百令胶囊/片/颗粒的原料药，为新鲜冬虫夏草中分离得到的麦角菌科真菌冬虫夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]的无性世代中国被毛孢经液体发酵培养所得菌丝体的干燥粉末。菌种鉴定多采用显微形态鉴别，主要从分生孢子的形态、菌落颜色及有无隔膜和菌环等进行描述。分子生物学技术用于虫草菌菌种的鉴定虽然有文献报道，但实际应用于菌种鉴定较少。究其原因，一方面，尚未建立专属性强、操作简便的分子鉴定检验标准，另一方面，企业从成本核算的角度考虑，更偏向于显微形态鉴定。

基于上述情况，我们提出了一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法，该方法从分子水平对制剂及原料药的真菌来源即中国被毛孢菌进行了准确、专属的鉴定，保证了菌种、原料药到制剂的菌种专一性和稳定性，即保证菌种在生产传代过程中不发生变异，进而保证菌种和原料药及制剂的质量稳定与可控。

发明内容

本发明提供一种中国被毛孢菌的引物、探针以及鉴定方法。

一种中国被毛孢菌的引物，所述特异性引物为5’CACCACAGCAGTTGCCT 3’和5’TCATTTGCTTGCTTCTTGACTG 3’。

一种中国被毛孢菌的探针，所述探针为5’CCTGTCGCAGTGGCATCTCT 3’。

本发明提供一种所述的引物和探针在制备检测中国被毛孢菌的试剂盒中的用途。

本发明提供一种所述的引物和探针的试剂盒。

本发明提供一种试剂盒检测中国被毛孢菌的用途。

一种中国被毛孢菌的鉴定方法，所述中国被毛孢菌的鉴定方法的PCR反应总体系为25μL，反应体系包括10×Buffer缓冲液2.5μL，dNTP(10mmol/L)1.0μL，引物(50μmol/L)各0.2μL，探针0.2μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.15μL，模板2μL，无菌超纯水18.75μL。

进一步地，所述PCR反应在95℃预变性5分钟，循环反应40次，其中95℃30秒，60℃30秒，72℃60秒，得到扩增曲线。

本发明的有益效果为：

本发明设计特异性引物和探针，优选后建立中国被毛孢菌、发酵冬虫夏草菌丝体及百令胶囊/片等各样品实时荧光PCR鉴别方法，从分子水平解决了发酵虫草类药材的真菌菌种鉴别难题。

附图说明