[发明专利]一种体外受精优化方法及其在动物大量快速繁殖中的应用

说明书

本发明提供了一种体外受精(In vitrofertilization，IVF)优化方法及其在动物中大量快速繁殖中的应用，使用该方法能显著提高体外受精后的卵裂率和生仔率，本发明还提供了一种受精培养液(HTFG)，包含该受精培养液的体外受精体系可以提高精子体外受精的卵裂率和生仔率。

技术领域：

本发明属于辅助生殖技术领域，具体涉及一种体外受精优化方法及其在动物大量快速繁殖和保种中的应用。

背景技术：

基于科研和应用研究对所需C57BL/6小鼠(以下简称B6小鼠)品系的多种技术服务需求中，大量快速扩群繁殖尤为重要，其中冷冻精子品系的短时间大量获得活体小鼠更受关注。

目前针对小鼠快速扩群生产的方法主要包括交配扩繁和体外受精(In VitroFertilization，以下简称IVF)生产两种方式，其中基于IVF体系的辅助生殖技术具有快速、高效、节约成本、对小鼠的质量要求较低等优点。IVF是体外生产技术中的核心步骤，在大量快速繁殖中起着至关重要重要的作用。正常受精过程包括精卵识别、精卵结合、精卵融合和父母双方基因组的有序整合等等。IVF技术的重点内容是精子体外获能。目前，精子体外获能方法在许多物种已相当成熟。在一个稳定的获能体系中，精子质量和精子浓度常常是影响IVF技术的变量因素。IVF技术的实验操作时间虽然不长，但也可能产生一些重要问题，比如多精受精(Polyspermy)，这一现象使得胚胎遗传物质的组成发生异常，导致胚胎发育率低。多精受精可能是由于精子浓度高造成，但也和卵细胞的成熟质量有关。还有研究表明微管微丝(Microfilaments)也影响着受精过程中纺锤体的旋转、精卵结合、皮质颗粒的分泌、第二极体的排出等一系列活动。在小鼠的精卵结合中，发现微丝微管的调节器JAS(Jasplakinolide)发挥着抑制作用。有研究报道在精卵结合中，与细胞骨架有关的ρ蛋白利于受精的发生。小鼠的IVF胚胎也存在一定的发育缺陷，特别是多精受精导致的胚胎异常发育对于小鼠IVF的效率影响很大，因此研究小鼠IVF胚胎发育过程中如何降低多精受精率，提高IVF胚胎卵裂率和发育率具有重要的实用价值。

传统的哺乳动物自然交配繁育技术受很多因素的影响，如动物性别、周龄和自身营养状态等。随着辅助生殖技术的发展，精子体外获能方法和胚胎体外培养体系在许多物种已相当成熟，但IVF技术的重点内容是提高精子体外获能和降低胚胎畸形率。在一个稳定的体外受精体系中，培养液常常是影响IVF技术的变量因素。

在体外受精过程中，一些物质被添加进受精液中以提高精子活力。GSH作为精子和卵细胞主要的非蛋白类抗氧化物质，具有提高精子活力，清除受精液中的ROS，调节精子中cAMP水平等作用。因此，在受精液中添加GHS能够提高受精后胚胎发育能力。

朱佳伟在其研究中发现，在小鼠体外受精中，通过在各个GSH添加组中受精后的卵裂率只有当GSH的浓度为300毫摩尔时才有较明显的提高，而其他各组之间差异不显著，从而认为低浓度的GSH并不能很高地保护精子使其免受ROS的伤害(“GSH对小鼠卵细胞体外受精成熟体外受精的影响”，硕士学位论文，东北农业大学，2008年)。

但是高浓度的GSH也会起到相反的作用。Boquest AC等(1999)的研究表面，在牛受精液中添加500微升的GSH会降低囊胚发育率。Jeong BS等(2001)也发现，在猪受精液中添加高浓度的GSH会降低卵裂率和囊胚率。因此降低对GSH的依赖也同时提高卵裂率和囊胚率。因此，寻找GSH浓度的最优范围是一个值得努力的方向。

并且，受精胚胎的卵裂依赖于培养体系的营养成分和PH值等，目前已成为亟待解决的问题。

发明内容：

本发明目的在于寻找一种更好的体外快速繁殖和保种的体系，提高受精和早期胚胎的质量，为动物的体外生产技术和辅助生殖技术提供优化的方案，提高繁育速度，缩短获得实验材料的时间，加速科研进程。

本发明的第一方面，提供了一种受精培养液(HTFG)，所述的受精培养液包含受精液(HTF)和可选的包括还原型谷胱甘肽(GSH)。