[发明专利]小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针、试剂盒及检测方法

说明书

一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT‑RPA检测的引物和探针、试剂盒及检测方法，包括上游引物、下游引物和探针，所述试剂盒用于小鼠肝炎病毒检测，试剂盒包括上述的上游引物、下游引物、探针，还含有逆转录酶、结合单链核酸重组酶、单链DNA结合蛋白酶、链置换DNA聚合酶、RNA酶抑制剂、再水化缓冲液、醋酸镁溶液、酶扩增八联管、阳性对照以及阳性对照。优点是：特异性高，准确度高，并且易保存运输，拥有良好的稳定性，可以监测整个检测过程。

技术领域

本发明属于生物核酸分子检测技术领域，具体涉及一种应用实时荧光反转录后重组酶依赖扩增技术检测(Reverse Transcript RecombinasePloymerase Amplification,RT-RPA)检测的引物和探针及试剂盒。

背景技术

冠状病毒科病毒是一类极为重要的致病病原体，感染的宿主范围较广，包括人、鸟类及多种哺乳类动物，可引起上呼吸道、胃肠道、肝脏及中枢神经系统等疾病。鼠肝炎病毒(Mouse Hepatitis Virus MHV)属于冠状病科冠状病属，不同年龄、品系和免疫状态的小鼠均可感染，感染可引起肝炎、脑脊髓炎和肠炎等不同症状。但在临床上小鼠多表现为隐性带毒感染，一旦与某些微生物发生混合感染，或在某些条件的刺激下，就会发生爆发流行。鼠肝炎病毒是感染啮齿类实验动物各种病毒中最难清除的病毒之一。感染鼠肝炎病毒的鼠群，各种免疫应答参数会发生改变，对实验结果产生各种影响，是实验动物国家标准GB14922-2011(实验动物微生物等级及监测)强制规定必检排除病原体之一。

目前，国内鼠肝炎病毒感染的诊断方法有很多，包括病毒分离与电镜观察和ELISA等传统方法，但这些方法即复杂又繁琐，耗时费力、灵敏性低等，不利于鼠肝炎病毒常规监测。美国Charles river和欧盟FELASA等实验动物质量检测实验室都推荐采用PCR技术作为实验动物病原的检测方法，然而PCR方法需要精确度高、操作复杂和价格昂贵的PCR仪，并且需要良好的实验条件和熟练的技术人员，且不适合用于现场快速检测，因此目前国内检测实验室对核酸检测方法的应用较少，虽然也有TR-LAMP检测技术用于鼠肝炎病毒检测，但TR-LAMP等温检测一般需要45-60min，需要较长时间完成检测，且需要同时精确设计6条引物，难度高操作复杂。

重组酶聚合酶扩增技术(Recombinase polymerase amplification RPA)，是由英国TwistDx Inc公司开发出来的一种不同于PCR的新型等温扩增技术。该技术主要包括：在37℃恒温下，该重组酶可与引物DNA紧密结合，形成酶和引物的聚合体，当引物在模板DNA上搜索到与之完全互补的序列时，在单链DNA结合蛋白(single-stranded DNA binding，SSB)的帮助下，使模板DNA解链，并在DNA聚合酶的作用下实现延伸。与普通PCR和荧光定量PCR相比，整个过程不需要高温变性和低温退火步骤，不需要昂贵的仪器，缩短了反应时间，操作简便，可满足现场应急对病原体快速诊断需求，近年来已经成为分子诊断行业的热点。RPA 在核酸扩增方面与PCR和其他技术一样有效，并且在简化实验条件和缩短反应时间方面取得了重大突破，目前国内外还没有将RPA技术应用于鼠肝炎病毒检测的报道。因此建立实时荧光RPA检测鼠肝炎病毒的方法十分必要。

RPA作为快速检测方法，反应灵敏，特异性敏感性高，但目前RNA病毒标准品的制备主要以RNA片段和整个病毒颗粒作为原料，但裸露的病毒片段易降解，不稳定，全病毒颗粒仍具有毒性，安全性较低。且由于其易受环境影响，易污染产生假阳性，准确度。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种可监测整个检测过程，特异性高，准确度高，并且易保存运输，拥有良好的稳定性的小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针、试剂盒及检测方法。

本发明的技术方案是：

第一方面，一种小鼠肝炎病毒实时荧光RT-RPA检测的引物和探针，所述引物分为上游引物和下游引物，上游引物、下游引物和探针序列分别如下：