[发明专利]山瑞鳖性别快速鉴定PCR引物组、位点、方法及试剂盒

权利要求书

1.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR引物组，其特征在于该引物组序列如下：

雌性特异正向引物如 SEQ ID No.1所示；

雌性特异反向引物如SEQ ID No.2所示；

内参正向引物如SEQ ID No.3所示；

内参反向引物如SEQ ID No.4所示。

2.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于该方法是：

将待检测山瑞鳖提取基因组DNA；以上述基因组DNA为模板，用SEQ ID No.1、SEQ IDNo.2、SEQ ID No.3、SEQ ID No.4所示引物进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出现1589bp大小的条带且存在内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雄性。

3.根据权利要求2所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于PCR扩增反应体系为：

50ng/μL山瑞鳖DNA模板 1μL

10μM雌性特异正向引物 2.5μL

10μM雌性特异反向引物 2.5μL

10μM内参正向引物 0.2μL

10μM内参反向引物 0.2μL

TaqMix 25μL

双蒸水 18.6μL；

PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程30个循环，最后72℃延伸5min。

4.一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于该方法是：

以山瑞鳖全血作为样本，采用PicoPure DNA Extraction Kit的蛋白酶K进行样本裂解，得到样本裂解混合液；对样本裂解混合液采用SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQ IDNo.3、SEQ ID No.4所示引物进行PCR扩增；扩增产物进行电泳检测，当扩增产物出1589bp大小的条带且存在内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雌性；当扩增产物只出现内参引物的扩增条带时，山瑞鳖性别为雄性。

5.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于样本裂解体系包括山瑞鳖全血0.1-0.5μL，1ug/μL蛋白酶k溶液10.5-10.9μL；总体积共11μL。

6.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于样本裂解条件为65℃裂解30min，95℃灭活10min。

7.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于所述山瑞鳖全血为初孵稚鳖未脱落卵黄囊内存留的血液，或稚鳖、成鳖后肢皮肤针刺采集的血液。

8.根据权利要求4所述的一种快速鉴定山瑞鳖性别的PCR方法，其特征在于PCR扩增体系为：

样本裂解混合液 11μL

10μM雌性特异正向引物 2.5μL

10μM雌性特异反向引物 2.5μL

10μM内参正向引物 0.2μL

10μM内参反向引物 0.2μL

TaqMix 25μL

双蒸水 8.6μL；

PCR扩增条件是：94℃预变性5min,94℃变性30s,65℃退火30s,72℃延伸100s，变性到延伸过程30个循环，最后72℃延伸5min。

9.一种山瑞鳖性别快速鉴定试剂盒，其特征在于包括SEQ ID No.1、SEQ ID No.2、SEQID No.3、SEQ ID No.4所示引物。