[发明专利]小麦磷转运蛋白TaPHT1;9-4B在提高植物磷吸收能力的方法及其应用

权利要求书

1.小麦磷转运蛋白TaPHT1；9-4B在提高植物磷吸收能力的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1、TaPHT1.9-4B磷转运蛋白编码基因的克隆；

S2、TaPHT1.9-4B过表达载体的构建；

S3、水稻遗传转化与转基因水稻植株的检测；

S4、TaPHT1.9-4B过表达转基因水稻在水培与土培环境下的功能验证。

2.根据权利要求1所述的小麦磷转运蛋白TaPHT1；9-4B在提高植物磷吸收能力的方法，其特征在于：所述步骤S1包括以下步骤：

S1.1、小麦总RNA的提取：

a.采用Trizol法提取两叶一心期“周麦18”小麦幼苗根系的RNA，首先将0.1g新鲜采集的根系进行液氮研磨至粉末状，放入1.5mL无酶离心管中，加入1mL Trizol后，剧烈振荡混匀后，室温静置30min；

b.然后12000rpm低温(4℃)离心5min，吸取上清于新的离心管中，再加入1/3体积的氯仿，充分混匀后静止15min；

c.12000rpm低温(4℃)离心5min后，将上清液转移至新的离心管中，加入等体积的异丙醇，充分混匀，静止30min。12000rpm低温(4℃)离心5min后弃上清；

d.每管加入1mL75％乙醇(DEPC处理水配制)，充分洗涤，12000rpm低温离心5min，弃上清，重复两次。将RNA晾干后，加入40μL无酶水，冰上溶解，取1μL RNA溶液在紫外分光光度计测定RNA浓度与质量；

S1.2、反转录合成cDNA第一链：

e.利用反转录试剂盒(PrimeScript^TMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit)进行反转录合成cDNA第一链；

f.在100μL无酶离心管中依次加入：1μL oligo dT primer(50μM)，1μL dNTP mixture(10mM each)，2μg Total RNA，加无酶水至总体积为10μL，65℃保温5min后冰上迅速冷却；

g.将上述反应液依次加入4μL 5×PrimeScript II Buffer，1μL PrimeScript IIRTase(200U/μL)，0.5μL RNase Inhibitor(40U/μL)，4.5μL无酶水。42℃60min，95℃5min失活，冰上冷却，得到小麦cDNA；

S1.3、PCR扩增TaPHT1.9-4B基因CDS：根据小麦磷转运蛋白TaPHT1；9-4B基因(GenBankno.AIZ11192.1)在最新小麦基因组数据库中所对应的基因序列(TraesCS4B02G317000)，设计扩增引物TaPHT1；9-4B-CDS-F：ATGGCGACTGAACAGCTC，R：CTAAGCTTCGATGCCATCGT，引物合成由河南尚亚生物技术公司完成，以小麦cDNA为模板，PCR扩增TaPHT1；9-4B基因编码区(CDS)，PCR扩增体系包括：10μL 5×PrimeSTAR Buffer(Mg^2+Plus)，0.5μLPrimeSTAR HSDNApolymeras(2.5U/μL)，4.0μL dNTP Mixture(2.5mM each)，TaPHT1；9-4B-CDS-F、R引物(10μM)各1.0μL，1.0μLcDNA，加ddH₂O至总体积为50μL。PCR扩增程序为第一步：94℃5min；第二步：94℃30s，56℃30s，72℃2min，32个循环；第三步72℃5min，将PCR产物经过1.0％的琼脂糖凝胶电泳分离，结果如图1所示，PCR产物的条带大小为1566bp，回收PCR产物，与pMD19-T载体酶连后转化大肠杆菌DH5α感受态，氨苄青霉素(100μg/mL)平板筛选，菌落PCR检测，将阳性克隆测序并提取质粒，测序结果与中国春小麦基因组中的参考序列一样(同源性达到100％)，该基因不含内含子，编码区包含1566bp核苷酸，编码521个氨基酸(如图2所示)。

3.根据权利要求2所述的小麦磷转运蛋白TaPHT1；9-4B在提高植物磷吸收能力的方法，其特征在于：所述步骤d中，当OD260/OD280的值在1.80-2.00之间，OD260/OD2302.0，说明RNA的质量较好，可作为反转录的模板。