[发明专利]一种观察碱蓬胚珠形态和发育过程的方法

权利要求书

1.一种观察碱蓬胚珠形态和发育过程的方法，其特征在于：包括如下步骤：

(1) 取材：选取从孢原细胞开始直至胚囊成熟不同发育时期的胚珠；

(2) 固定：FAA固定液固定48h，50%乙醇冲洗3-5次，转入70%乙醇中并停留30-40min，在解剖镜下解剖分离出不同时期的子房或胚珠；

(3) 染色：以40%、30%、20%乙醇梯度脱水和蒸馏水复水，3%硫酸铝钾溶液媒染60min，在含10mg/L曙红的4%蔗糖溶液中染色24-48h，2%硫酸铝钾溶液分色60min，水洗3-5次；

(4) 脱水：以体积浓度为10%、20%、30%、50%、70%、80%、90%、无水乙醇的梯度乙醇脱水，无水乙醇重复3次；

(5) 透明：先用透明剂透明30min，再用无水乙醇（v）：水杨酸甲酯（v）= l：1的混合液过渡停留1-2h，最后用纯水杨酸甲酯透明3-4h；

(6) 观察：透明后将子房放在滴有水杨酸甲酯的凹面玻片上进行整体封片；在LeicaSP2激光扫描共聚焦显微镜下用543nm波长的激光激发荧光进行成熟胚囊整体分层扫描观察，并获取图像。

2.根据权利要求1所述的一种观察碱蓬胚珠形态和发育过程的方法，其特征在于：所述透明剂为水合氯醛（m）：水（v）：甘油（v） =8：2：1；所述FAA固定液为70%乙醇：冰乙酸：甲醛体积比=80：6：3。

3.根据权利要求1所述的一种观察碱蓬胚珠形态和发育过程的方法，其特征在于：步骤（6）中，每个胚囊分30层扫描，每层2um；选取摆放方向正确即以在最大层面上同时可见胚囊的卵器、极核和反足细胞团为准的胚囊录取图像；分层扫描的单层图像用 Leica SP2 激光扫描共聚焦显微镜系统提供的图像合并功能，合并后用Photoshop处理。