[发明专利]用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针及检测方法

权利要求书

1.一种用于基因水平ABO嵌合体的Taqman水解探针，其特征在于：包括三种TaqMan水解探针，它们分别为：

探针261：FAM-TCAACATCGACATCCTCAACGAGCA-BHQ；

探针467：FAM-CGCGGTGCCCCGCGTGA-BHQ；

探针803：FAM-GGGATGTAGGCCTGGGACTGGGGCCGGC-BHQ。

2.一种用于基因水平ABO嵌合体的检测方法，其特征在于：具体包括以下步骤：

（1）内参白蛋白基因标准曲线的建立：取一份高质量的基因组DNA作为标准品，用分光光度计重复测定基因组DNA的浓度8次，然后计算得到基因组DNA的浓度平均值， 再使用TE缓冲液进行稀释并调整得到浓度为100ng/µL的DNA溶液，接着使用TE缓冲液对所述DNA溶液进行倍比梯度稀释，得到浓度依次为50ng/µL、25ng/µL、12.5ng/µL、6.25ng/µL、3.125ng/µL、1.5625ng/µL的稀释液；

将各个稀释浓度的基因组DNA溶液分别作为DNA模板进行白蛋白内参基因PCR扩增反应，所述白蛋白内参基因PCR扩增反应的体系总体积为20µL，其具体包括2×Hieff^TM qPCRGreen Master Mix试剂盒的反应mix液10µL、DNA模板2.0µL、白蛋白上游引物0.8µL、白蛋白下游引物0.8µL，余量为无菌双蒸水；所述白蛋白上游引物和白蛋白下游引物的浓度均为10µM；

所述白蛋白上游引物为TGTTGCATGAGAAAACGCCA；

所述白蛋白下游引物为GTCGCCTGTTCACCAAGGAT；

所述内参基因PCR扩增反应的程序参数为：

S1.95℃预变性 5min；

S2.扩增循环参数：95℃ 10s，60℃ 30s，75℃ 1s，共40个循环；

S3.熔解曲线分析参数：95℃ 15s，60℃ 60s，95℃ 15s，检测范围60℃～95℃，温度变化率为0.1℃/s；

根据测定结果绘制白蛋白基因的扩增曲线、熔解曲线和标准回归曲线；

（2）取待测血样进行DNA的提取，具体是先取血样2mL于EDTA抗凝管中得到EDTA抗凝血，然后取EDTA抗凝血100μL于EP管中，接着加入100 μLNaI，涡旋振荡2~3 min，接着加入200 μL抽提剂抽提3 min，再在13000 r/min的条件下离心5 min，取上清液至新的EP管中，再加入200 μL异丙醇摇匀，然后在13000 r/min的条件下离心5 min，接着弃上清液，加入1mL体积浓度为70%的乙醇，在13000 r/min的条件下离心5 min，再弃上清液得到沉淀，然后将沉淀干燥后再加入20μL的灭菌双蒸水溶解得到待测DNA；所述抽提剂是氯仿和异戊醇按照体积比24:1的比例均匀混合得到的；

（3）取5μL待测DNA用灭菌双蒸水稀释至1.0 mL得到待测样品，测定待测样品在260nm、280nm和310n m处的吸光度OD值，计算每个待测样品的浓度，将待测样品作为DNA模板，按照步骤（1）中所述的白蛋白内参基因PCR扩增反应进行扩增，根据所得到的扩增曲线和步骤（1）中得到的标准回归曲线分析计算得到待测样品的浓度，以此对待测样品的浓度进行校正，然后调节待测样品中DNA的浓度至20ng/μL；

（4）PCR扩增反应：将步骤（2）中得到的待测样品分别作为检测模板进行PCR扩增反应，先将引物组261、引物组467、引物组803和三个水解TaqMan探针分别用双蒸水稀释成10pmol/μL的溶液，然后与检测模板、2×Probe PCR Master Mix试剂和灭菌双蒸水混合得到用于检测261突变位点、261正常位点、467突变位点、803突变位点、803正常位点的扩增反应体系溶液；每个待测样品重复检测2次；

所述引物组261由以下引物组成：

上游引物261-mut：GGAAGGATGTCCTCGTGGCA；

上游引物261-nor：GGAAGGATGTCCTCGTGGCG；

下游引物261：CTTGATGGCAAACACAGTTAAC；

所述引物组467由以下引物组成：

上游引物467-mut：TATGTCTTCACCGACCAGTT；

下游引物467：CGCTCGCAGAAGTCACTGAT；

所述引物组803由以下引物组成：

上游引物803：CTCCGCTGTTCGGCACCCTG；

下游引物803-mut：CCGACCCCCCGAAGAAAG；

下游引物803-nor：CCGACCCCCCGAAGAAAC；

所述2×Probe PCR Master Mix试剂是由QIAGEN 公司生产的 QuantiNova^TM ProbePCR kit 的 2×Probe PCR Master Mix；

每个扩增反应体系溶液中待测样品中DNA的起始定量浓度为20ng/µL；

用于检测261突变位点的扩增反应体系溶液的体积为20μL，其具体由以下体积的组分组成：2×Probe PCR Master Mix试剂10μL、检测模板2.5μL、上游引物261-mut和下游引物261的体积各为1.0μL、探针261的体积为0.5μL，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；

用于检测261正常位点的扩增反应体系溶液的体积为20μL，其具体由以下体积的组分组成：2×Probe PCR Master Mix试剂10μL、检测模板2.5μL、上游引物261-nor和下游引物261的体积各为1.0μL、探针261的体积为0.5μL，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；

用于检测467突变位点的扩增反应体系溶液的体积为20μL，其具体由以下体积的组分组成：2×Probe PCR Master Mix试剂10μL、检测模板2.5μL、上游引物467-mut和下游引物467的体积各为1.0μL、探针467的体积为0.5μL，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；

用于检测803突变位点的扩增反应体系溶液的体积为20μL，其具体由以下体积的组分组成：2×Probe PCR Master Mix试剂10μL、检测模板2.5μL、上游引物803和下游引物803-mut的体积各为1.0μL、探针803的体积为0.5μL，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；

用于检测803正常位点的扩增反应体系溶液的体积为20μL，其具体由以下体积的组分组成：2×Probe PCR Master Mix试剂10μL、检测模板2.5μL、上游引物803和下游引物803-nor的体积各为1.0μL、探针803的体积为0.5μL，余量为灭菌双蒸水；接着将所得到的扩增反应体系溶液在荧光定量PCR仪中依次进行如下扩增反应程序：95℃预变性2min，扩增循环参数为95℃变性5s，60℃ 30s，共40个循环；

（5）结果检测：通过荧光定量PCR仪自带软件绘制扩增曲线并读取相应的Ct值并进行结果判定。