[发明专利]一株分泌2,4-D单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

说明书

一株分泌2,4‑D单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用，属于食品安全免疫检测领域。本发明2,4‑D完全抗原与等量弗氏佐剂混合乳化完全，通过背部皮下注射免疫BALB/c小鼠。首次免疫用完全弗氏佐剂，多次加强免疫用不完全弗氏佐剂，最后一次用2,4‑D完全抗原冲击免疫。取高效价低ICsubgt;50/subgt;小鼠的脾细胞，通过PEG方法与小鼠骨髓瘤细胞融合，经过间接竞争酶联免疫法筛选和三次亚克隆，得到一株杂交瘤细胞株。此细胞株分泌的单克隆抗体，对2,4‑D具有较好的特异性和检测灵敏度，ICsubgt;50/subgt;值为1.7ng/mL，为食品中2,4‑D残留的免疫检测提供了原料，具有实际应用价值。

技术领域

本发明涉及食品安全免疫检测领域，尤其是涉及一株分泌2,4-D单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用。

背景技术

2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)，是人工合成、类似于生长素的一种植物生长调节剂、除草剂，主要作为有机除草剂在农业中使用。它能扰乱植物体内激素平衡，广泛应用于水稻、小麦、高粱、甘蔗、玉米等单子叶作物的生产中，防治阔叶杂草。另外，2,4-D还可以作为水果和蔬菜的防腐剂，延长其保质期。由于其成本低，2,4-D的使用逐年增加。因此，对人和环境的危害也在增加。喷洒在土壤表面的除草剂渗入土壤，污染地下水和地表水。同时，它很容易通过皮肤和呼吸进入人体，导致中毒。

为了有效监督监测食品中使用2,4-D的情况，需要寻找一种特异性好，灵敏度高的测定方法，而目前相关技术中，检测方法如薄层层析法、气相色谱法、液相色谱法等，分离纯化过程冗长，灵敏度低，加上食品中干扰物多，难以获得准确结果。因此建立快速简便的2,4-D检测方法具有重要意义。建立高效的免疫学检测方法，筛选高特异性的单克隆抗体是重要前提。

发明内容

本发明的目的是提供一株2,4-D单克隆抗体杂交瘤细胞株，由该细胞株制备的抗体对2,4-D具有较好特异性和检测灵敏度，可以用来建立2,4-D的免疫学检测方法。

本发明的技术方案，一株2,4-D单克隆抗体杂交瘤细胞株，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC No.22332。

本发明的另一目的是提供2,4-D单克隆抗体，其由所述保藏编号为CGMCCNo.22332的杂交瘤细胞株分泌产生。

本发明的又一目的是提供2,4-D单克隆抗体的制备方法，由2,4-D原药与蛋白的偶联物免疫小鼠后获得。

本发明的再一目的是提供一种所述2,4-D单克隆抗体的应用，用于食品安全检测中2,4-D残留的分析检测。

本发明第五个目的是提供一种试剂盒，该试剂盒包含所述的2,4-D单克隆抗体。

本发明第六个目的是提供一种试剂盒，应用在检测2,4-D含量中，进一步地，用于食品安全检测中2,4-D的分析检测。

本发明提供的分泌2,4-D单克隆抗体的杂交瘤细胞株的制备基本步骤为：

(1)完全抗原的制备：

a、免疫原2,4-D-BSA的制备：2,4-D药物的化学结构中具有羧基官能团，可直接作为半抗原与蛋白进行偶联，具体操作如下：称取1mg 2,4-D原药(2,4-D原药和牛血清白蛋白(BSA)摩尔比为30:1)，1.56mg N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，溶解于300μL N,N-二甲基甲酰胺(DMF)中，室温搅拌反应10min；再称取2.6mg 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)，用100μL DMF充分溶解后，加入到2,4-D原药溶液中，室温搅拌反应6-8h(称为A液)。取牛血清白蛋白BSA 10mg，加入3mL硼酸缓冲溶液(称为B液)，在室温条件，逐滴将A液加入到B液中，室温反应过夜，即得偶联物2,4-D-BSA混合液，通过透析分离完全抗原和未偶联的小分子半抗原；