[发明专利]一种用于快速检测草莓轻型黄边病毒的特异性核酸序列及其扩增引物、试剂盒及方法

说明书

本发明公开一种用于快速检测草莓轻型黄边病毒（SMYEV）的特异性核酸序列及其扩增引物、试剂盒及方法。本发明基于草莓轻型黄边病毒基因组设计草莓轻型黄边病毒基因组特异性保守序列，同时设计了特异性专用引物。本发明通过筛选草莓轻型黄边病毒特异保守引物和探针，基于逆转录‑重组酶聚合酶恒温扩增（RT‑nfo‑RPA）方法，优化恒温扩增条件，结合试纸条将扩增产物结果可视化，在探索草莓样本核酸RNA现场快提的基础上，实现草莓轻型黄边病毒简单、快速、高灵敏检测，并将检测所需试剂和器材组装成易于携带和可供现场使用的试剂盒，适用于草莓种苗繁育、脱毒培养、田间调查时草莓轻型黄边病毒SMYEV快速检测和生产应用。

技术领域

本发明属于草莓轻型黄边病毒检测技术领域，具体涉及一种用于快速检测草莓轻型黄边病毒的特异性核酸序列及其扩增引物、试剂盒及方法。

背景技术

草莓(Fragaria×ananassa)为蔷薇科(Rosaceae)草莓属(Fragaria)宿根性多年生草本植物。草莓病毒病在世界各地分布广泛，削弱植株生长势，降低产量和品质，危害草莓生产。目前已报道的可浸染草莓的病毒有20多种，其中草莓轻型黄边病毒(Strawberrymild yellow edge virus，SMYEV)是危害草莓较为严重的一种病毒，也是危害草莓生产的4种主要病毒之一。

由于草莓种苗通过匍匐茎营养繁殖而来，一旦母株带毒，繁殖的后代均带毒。植物病毒病害一旦发生难以控制，造成植株的长势减弱，从而增加了其他病害的浸染几率，若从根本上解决病毒病的危害，需提前对草莓组培苗和种苗圃草莓进行病毒病的检测筛选，后及时清除携带病毒种苗，从而可保证在生产中使用无毒种苗栽培。随着分子生物技术的发展，草莓轻型黄边病毒(SMYEV)分离、克隆、PCR检测、实时荧光定量PCR检测和RT-LAMP检测等方面有一些研究进展。

重组酶聚合酶恒温扩增(Recombinase polymerase amplification，简称RPA)是一种由重组酶、单链DNA结合蛋白和链置换Bsu聚合酶参与的恒温扩增新技术，可在23-45℃下连续进行反应，反应时间只需5-20min，特异性强，灵敏度高，非常适用于现场检测和疾病控制。RPA技术在核酸特异性扩增和检测领域已经显示出强大的威力，检测灵敏度比LAMP和PCR高，具有取代PCR扩增和检测的趋势，但该技术在草莓领域的应用研究较少。

逆转录-重组酶聚合酶恒温扩增(Reverse transcription-Recombinasepolymerase amplification，简称RT-RPA)技术，该检测技术的第一步是将病毒RNA片段逆转录为cDNA以便于后续核酸扩增；接下来用RPA恒温扩增的方式，搭配合适探针，进而实现对cDNA的指数扩增以及对扩增后的核酸产物的检测。检测结果既可以通过观察荧光、琼脂糖凝胶电泳，也可以用更为简便的试纸条方式呈现出来。

但是，目前对于草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的检测，并没有上述相关技术有效的应用。

发明内容

发明目的：针对上述技术问题，本发明第一个目的是提供一种草莓轻型黄边病毒特异性核酸序列，其克隆来自草莓轻型黄边病毒(SMYEV)基因组，为草莓轻型黄边病毒(SMYEV)基因组特异性保守序列。

本发明要解决的第二个目的是提供用于检测草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的专用引物，其特异性强，灵敏度高。

本发明第三个目的是提供一种包括上述引物的试剂盒，并且其中还包括探针。

本发明第四个目的是提供一种利用上述引物或试剂盒快速检测草莓轻型黄边病毒(SMYEV)的方法，其操作简单、耗时短、灵敏度高。

为实现上述目的，本发明的技术方案如下：