[发明专利]氧化石墨烯基氮三乙酸-铈配合物的制备方法及其应用

说明书

本发明公开了一种氧化石墨烯基氮三乙酸‑铈配合物的制备方法及其应用。首先，采用将氧化石墨烯(GO)与氮三乙酸(NTA)反应使其羧基化，并结合上铈离子(Ce⁴⁺)形成氧化石墨烯与铈的纳米复合物(GO‑NTA‑Ce)。GO‑NTA‑Ce是具有类DNase活性人工酶，对细菌被膜胞外基质中重要组分eDNA表现出高的剪切能力。当位于细菌相关感染位点时，GO‑NTA‑Ce能够长时间抑制生物被膜的形成，并且可有效分散不同年龄的已形成的生物膜。除了Ce介导的类DNase活性作用外，近红外光照射GO‑NTA‑Ce可产生局部高热杀死受被膜保护的细菌。石墨烯本身通过物理损伤和化学损伤发挥其抗菌作用。本发明能通过类DNase酶特性、光热治疗和石墨烯广谱抗菌的三重作用，有效地根除耐药细菌生物被膜感染，具有治疗MDR细菌生物被膜感染的巨大潜力。

技术领域

本发明属于纳米生物医学领域，具体涉及一种氧化石墨烯基氮三乙酸-铈配合物(GO-NTA-Ce)的纳米酶抗细菌生物被膜感染平台。

背景技术

在过去几十年以来，细菌感染性疾病已经成为世界上最大的健康问题之一，引起了人们持续而广泛的关注。与细菌的战斗中，医疗水平不断提高的同时，细菌耐药性的问题也呈现扩大化。值得注意的是，与浮游细菌相比，细菌生物膜的形成，已成为更普遍的耐药性感染的原因。其中，细胞外DNA(eDNA)参与生物膜的形成发挥了关键作用。增加细胞聚集的强度和参与生物膜的形成，结构稳定及其过程中细胞运动的协调，对抗生素的耐药性发展以及遗传性状的传播。因此，锚定eDNA这一关键靶点，并受到天然DNase的解离机制和分子结构的启发，化学家们最近努力构建了大量具有高催化转化率和稳定性的廉价的酶模拟物。可长时间地有效防止生物膜的形成，并良好地显示出分散了已成熟的顽固生物膜基质，比单一的天然酶具有更好的治疗能力。

GO-NTA-Ce纳米酶平台能够通过类DNase酶特性、光热治疗和石墨烯广谱抗菌的三重作用，有效地根除耐药细菌生物被膜感染，具有治疗MDR细菌生物被膜感染的良好前景。

发明内容

发明目的：本发明提供一种氧化石墨烯基氮三乙酸-铈配合物的纳米酶抗细菌生物被膜感染平台，采用较为先进的方法制备氧化石墨烯。然后，进一步将氧化石墨烯与氮三乙酸反应使其羧基化，并结合上含铈的化合物，通过简易的层层递进的方法即可形成覆盖多个Ce配合物的GO(氧化石墨烯)纳米酶平台。当位于细菌相关感染位点时，GO-NTA-Ce能够长时间抑制生物被膜的形成，并且可有效分散不同年龄的已形成的生物膜。除了Ce介导的类DNase活性作用外，近红外激光照射GO-NTA-Ce可产生局部高热杀死受被膜保护的细菌。此外，石墨烯本身也是一种新型的绿色广谱抗菌材料，可通过物理损伤(如用其尖锐的边缘与细菌膜直接接触和脂质分子的破坏性提取)和化学损伤(由氧化应激引起的活性氧产生和电荷转移)发挥其抗菌作用。

技术方案：本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：一种氧化石墨烯基氮三乙酸-铈配合物的纳米酶抗细菌生物被膜感染平台，包含有如下步骤：

(1)GO-NTA-Ce纳米酶的制备；将30-50mg氧化石墨烯纳米片分散在10-20mL去离子水中，然后超声处理1-2h，形成均匀的悬浮液。取0.5-1mL悬浮液与50-100mg EDC置于10-30mM的MES缓冲液中反应10-20min，为了更稳定，我们加入NHS反应1-3h来固化羧基。然后，加入2-8mg NTA(氮三乙酸)反应至24-36h后，离心收集沉淀物。用去离子水清洗1-3次后，产品被冷冻干燥使用。最后，为了在透射电子显微镜下观察其形貌以及与细菌的相互作用，取1-10μL浓度为10-200μg·mL^-1的GO-NTA-Ce纳米酶制作样品。

(2)对成熟生物被膜较好的降解能力；将20-200μL浓度为20-100μg·mL^-1的GO-NTA-Ce纳米酶与生物被膜共孵育在24孔板上；在37℃孵育6-12h后，NIR处理组进一步暴露于808nm(2-8W·cm^-2)激光下6-10min。最后，采用活/死染色法与结晶紫染色法检测对成熟生物被膜的降解程度。