[发明专利]一种基于NGS技术检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系

权利要求书

1.一种基于二代测序平台（Next generation sequencing, NGS）检测四种类型129个分子遗传标记的复合扩增体系，其特征在于位于常染色体上的48个始祖信息单核苷酸多态性（ancestry informative single nucleotide polymorphism, AISNP）、18个多等位基因缺失/插入多态性（insertion/deletion polymorphism, InDel）、27个微单倍型和位于Y染色体上的36个SNP/InDel位点的引物信息；检测体系的试剂组分；文库构建和测序数据分析的流程。

2.根据权利要求1所述，所述体系中包含的48个AISNP、18个多等位基因InDel、27个微单倍型和36个Y-SNP/InDel的引物信息；48个AISNP的引物序列为Seq1-Seq96，18个多等位基因InDel的引物序列为Seq97-Seq132，27个微单倍型的引物序列为Seq133-Seq300，36个Y-SNP/InDel的引物序列为Seq301-Seq372。

3.根据权利要求1所述，研发的试剂中所包含的组分PCR Enzyme Mix、PCR PrimerPool、PCR Block、PCR Dual Barcode Primer F和PCR Dual Barcode Primer R试剂。

4.根据权利要1所述，研发的体系的操作步骤如下所示：

1）测序文库构建和纯化；第一轮PCR混合液包括12.5µL PCR Enzyme Mix、4µL PCRPrimer Pool和3.5µL的样本DNA；PCR反应条件为95℃变性5min；98℃变性15s，64℃和60℃各1min，72℃延伸30s，共14个循环；72℃终延伸2min，然后4℃保存；

在完成第一轮PCR后，需对其进行纯化处理；具体操作如下：吸取26µL磁珠加入第一轮PCR产物中，用移液器快速吹打使其混合均匀，室温孵育5 min；然后，将PCR产物置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器小心移弃上清；加入100µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，轻轻吹打后吸弃上清，重复该步骤1-2次，吸干管内液体，室温干燥至磁珠表面无反光、无开裂；最后，从磁力架上取下PCR产物，加入6.5µL TE Buffer进行DNA洗脱；

第二轮PCR混合液包括12.5μL PCR Enzyme Mix，2μL PCR Block，2μL PCR DualBarcode Primer F，2μL PCR Dual Barcode Primer R和纯化后的第一轮PCR产物；PCR反应条件为98℃变性5min；98℃变性15s，64℃、60℃和72℃各30s，共16个循环；72℃反应2min，4℃保存；

然后，采样相同的纯化方法对第二轮PCR产物进行纯化处理，不同的是最后加入23μLTE Buffer进行DNA洗脱；将洗脱液放置在磁力架上，待液体澄清后，取21μL转移至新的离心管；

2）测序文库的定量；采用Quant-iTTM PicoGreen® dsDNA Assay Kit双链DNA荧光定量

试剂盒，对纯化后的第二轮PCR产物进行定量；根据定量结果将待测样本混合在一个孔内，混合总量为500 ng；

3）测序文库的环化及酶切消化；将构建好的文库移至新的0.2 mL离心管中，用TEBuffer

补充总体积至48µL；将离心管置于PCR仪上，95℃变性3min，立即置于冰上静置2 min后瞬时离心；将11.6µL Dual Barocde Splint Buffer和0.5µL DNA Rapid Ligase加至上一步变性后的溶液中，放置于PCR仪中，37℃反应10 min；配置酶切消化液，包括1.4µLDigestion Buffer和2.6µL Digestion Enzyme，加入反应后的溶液中，瞬时离心，然后放置于PCR仪中，37℃反应30 min；反应结束后，向离心管内加入7.5µL Digestion StopBuffer，瞬时离心后，将所有反应液转移至新的离心管中；吸取170µL DNA Clean Beads加至上一步的溶液中，用移液器轻轻吹打至完全混匀，室温孵育5 min；将离心管置于磁力架，静置5 min至液体澄清，用移液器吸取、丢弃上清；保持离心管于磁力架上，加入500µL新鲜配制的80%乙醇漂洗磁珠及管壁，静置30 s后吸取、丢弃上清，重复该步骤1-2次；保持离心管固定于磁力架上，室温干燥至磁珠表面无反光和开裂；将离心管从磁力架上取下，加入25µL TE Buffer进行DNA洗脱，用移液器轻轻吹打至完全混匀；室温下孵育5 min，瞬时离心，将离心管置于磁力架上，静置至液体澄清，将23µL上清液转移到新的离心管中；采用Qubit® ssDNA Assay Kit荧光定量试剂盒，对上一步纯化后产物进行定量，最后取10 ng产物制备DNA Nano Ball；

4）测序反应和数据分析；将制备好的DNB放置于MGISEQ-2000RS基因测序仪上进行测序反应；在完成测序反应后，采用Soapnuke软件对原始数据进行预处理；然后，采用BWA软件将质控后的序列和人类参考基因组进行比对；最后，采用FreeBayes软件确定遗传标记的等位基因分型。