[发明专利]一种基于荧光染料摄取的批量半通道功能水平检测方法

说明书

一种基于荧光染料摄取的批量半通道功能水平检测方法：(1)悬浮培养，取悬浮培养细胞系的THP‑1细胞，使用添加β巯基乙醇的RPMI1640培养液，定期添加或替换培养液保障细胞的生存环境稳态；监测细胞悬液浓度不超过1×10⁶个/ml；细胞悬液调整浓度为4×10⁵个/ml，添加十四烷酰佛波醇乙酸酯，细胞悬液接种于96孔板，24小时后换液去除未贴壁细胞；使用空白RPMI1640培养液维持培养以去除十四烷酰佛波醇乙酸酯的作用效应；(2)荧光染料摄取检测半通道活性，溴化乙锭为荧光染料，使用标准RPMI1640培养液配置溴化乙锭荧光染色储备液，将溴化乙锭染色储备液加入96孔板中，添加荧光染液后将96孔板置于冰上，避光孵育，将96孔板置入荧光酶标仪检测荧光强度结果。

技术领域

本发明属于蛋白通道结构和功能研究领域，具体地涉及一种基于荧光染料摄取的批量半通道功能水平检测方法。

背景技术

动物细胞在由独立通讯途径形成的复杂网络中相互作用，包括直接 (细胞间)细胞接触和旁分泌/自分泌(细胞外)信号系统[EvansWH,E. DeVuyst,Leybaert L(2006).Thegap junction cellular internet:Connexin hemichannels enter the signallinglimelight.Biochem J 397:1–14.]。这一系统主要由广泛表达于体内多种细胞的间隙连接蛋白的特定功能实现。间隙连接蛋白六聚体可以在细胞膜上形成一种通道形式的结构，相邻两个细胞的间隙连接蛋白六聚 体相连就构成了细胞间隙连接通讯(gap junctionintercellular communication，GJIC)，选择性允许小于1kD的分子或物质通过(如ATP、ADP、葡萄糖、谷氨酸、谷氨酰胺、第二信使如cAMP和三磷酸肌醇等)，在细胞代谢偶联和电偶联中具有重要作用[SAEZ J C, BERTHOUD V M,BRANES M C,et al.Plasma membranechannels formed by connexins:Their regulation and functions[J].PhysiolRev.2003,83(4): 1359-400.]。相对于GJIC这种“全通道”，间隙连接蛋白六聚体在未对接的质膜上可以作为独立的功能性通道存在，介导细胞内与细胞外间隙的物质交换(物质种类与GJIC相同)，与传统的GJIC的功能明显不同[许洛伊, 汪敬业,罗本燕,etal.Pannexins通道蛋白特性及研究方法进展[J].生理科学进展.2010,41(06):423-8.]，一般将这种通道结构称之为半通道 (hemichannel)。

脊椎动物中的通道蛋白有Connexin和Pannexin两类，一般认为后者仅可以构成半通道而无形成间隙连接通讯的功能。Connexin和Pannexin 没有序列同源性，但其蛋白在拓扑结构上具有很高的相似性(见图1A和图1B，分别为Connexins和Pannexins间隙连接蛋白拓扑结构图，两种连接蛋白的分子量分别为Connexin43：43kD，Pannexin 1：48.1kD)。这三个间隙连接蛋白家族均具有四个跨膜亲水片段，两个胞外环和一个胞内环。连接蛋白的羧基末端与氨基末端均位于胞内，氨基末端较为保守，羧基末端则差别较大，羧基末端对间隙连接的形成及调控有很大影响。