[发明专利]一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法

说明书

一种基于可变荧光统计学分布的藻类活体细胞数分析方法，包括：步骤1、从纯种均匀藻液样品中随机抽样得到多个子样本，子样本藻类活体细胞数服从泊松分布，近似为方差等于均值的正态分布；对于所述藻液样品，随机抽样得到的子样本中藻细胞的单细胞可变荧光量SCVF均值是一致的，子样本可变荧光Fsubgt;v/subgt;值也服从正态分布；步骤2：选取一个子样本可变荧光Fsubgt;v/subgt;值的分布参数，建立子样本可变荧光Fsubgt;v/subgt;值分布情况与样品藻细胞密度的关系；步骤3、针对纯种藻液，根据子样本可变荧光Fsubgt;v/subgt;值的分布参数求解样品中活体藻细胞密度。本发明根据均匀样品随机抽样的子样本细胞数与可变荧光量分布形状一致的特点，利用大量子样本可变荧光量的分布形状直接求出样品中藻类活体细胞数。

技术领域

本发明涉及资源与环境、海洋领域，尤其是一种基于可变荧光统计学分布的压载水藻类活体细胞数分析方法。

背景技术

海洋船舶压载水是世界上最大的非本土物种转移载体之一。这种大规模的海洋生物的移动引发的生物入侵事件频发，破坏了沿海生态系统，导致了生态和经济方面的巨大损失。为减少压载水排放造成的外来物种入侵，国际海事组织2004年通过了《国际船舶压载水和沉积物控制与管理公约》，其中的D-2条例规定了船舶的压载水排放中活生物体密度的上限，该公约要求船舶排放的压载水中含有的生物密度必须符合：最小尺寸在10μm至50μm之间的活生物体少于10个每毫升。已有研究表明，10μm-50μm之间的浮游生物的优势物种为浮游藻类，浮游藻类是海洋中的初级生产者，如果浮游藻类密度很低其他生物也会因为缺少营养而死亡，因此浮游藻类密度是压载水水质控制的理想参数，活体藻细胞密度的检测对控制压载水达标排至关重要。

当前，对于压载水中活体浮游藻类的检测，通常有两种类型的方法即“精细型”分析方法和“指示性”分析方法。“精细型”分析方法包含：显微镜分析法、流式细胞仪等，这类方法可直接精确测量样品中生物体的数量，但是通常比较耗时，且需要专业的技术人员以及昂贵的设备。其中显微镜分析法比较准确，是目前国内压载水活体藻细胞数检测的常用的标准方法，但是很费时且需要进行复杂的前处理。流式细胞仪应用于活体浮游藻类检测时，由于只能测量固定荧光不能测量可变荧光，而死亡细胞也可以发出固定荧光，所以测量出来的活体细胞数总是比实际活体细胞数要高。“指示性”方法依靠各种指标来评估样品中活生物体数量，因不需要复杂前处理，可实现原位快速测量，实际应用更加广泛，包括检测细胞能量的ATP方法，检测酶活性的FDA方法(satake脉冲计数)以及依赖于浮游植物的光合作用的叶绿素荧光法。但是这些方法只能在设定特殊的临界情况下或者通过曲线定标校准方式估算活体生物量，测量结果往往不够精准。

其中，叶绿素荧光法依赖于浮游植物的光合作用，几乎不需要样品处理，适用于快速估算浮游植物生物量，已被证明是适用于压载水合规性检测的工具。叶绿素荧光法是通过光诱导藻类释放的叶绿素荧光动力学信号强度来检测活体细胞数。已有研究提出，由叶绿素荧光诱导动力学曲线得到的可变荧光F_v(F_v＝F_m–F₀，F_m为饱和光下的最大荧光，F₀是初始荧光)与藻类活体细胞数具有良好的相关性，在复杂的背景荧光环境干扰下，F_v可以不受背景荧光的干扰，精准定量活体细胞数。这是因为F_v仅由活细胞贡献，而死亡的藻细胞失去贡献可变荧光的能力从而只贡献F₀和F_m。