[发明专利]一种能高效表达LL-37多肽的多拷贝重组表达载体及应用

说明书

本发明公开了一种能高效表达LL‑37多肽的多拷贝重组表达载体、重组毕赤酵母、构建方法及应用，本发明以PPICZα为骨架质粒来构建重组表达载体，所述的重组表达载体PPICZα包括信号肽α因子、拷贝的LL‑37序列。多拷贝重组载体质粒是用双酶切目标片段后进行回收、沉淀和连接，得到多拷贝的质粒；同时用BamH I线性化重组质粒pPICZαA‑LL‑37；乙醇沉淀法进行纯化，把多拷贝质粒与载体相连接，再与毕赤酵母电转化为感受态细胞。通过诱导表达产生目标蛋白；利用本发明的重组酵母能够有序合成并将目标蛋白分泌到胞外，产生与人源抗菌肽LL‑37相同功能的结构多肽。经过测量抑菌圈和最小抑菌浓度，检测LL‑37的活性。本发明得到的LL‑37具有广谱抗菌性，能够抑制大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种能高效表达LL-37多肽的多拷贝重组表达载体及应用。

背景技术

LL-37是一种人源抗菌肽，具有广谱抗菌性，不仅对革兰氏阴性菌有抑制效果，还能抑制革兰氏阳性菌。现在国内的奶业出口上还存在很大问题，因为牛奶的抗生素超标，而且现在抗生素的使用容易导致耐药菌的出现，从而出现“超级细菌”，因此这个问题亟待解决，并且添加到牛奶中的防腐剂超标也导致了牛奶的安全问题。而LL-37本质属于蛋白质，会在体内分解成基本单元的氨基酸，不产生耐药性，无残留问题，是一种新型的生物防腐剂，有很好的研究前景。

现在用大肠杆菌来诱导表达LL-37是比较成熟的原核表达系统，但是大部分为包涵体，需要变性和复性操作，此过程中LL-37损失严重，大大限制了LL-37的工业化生产。现有技术公开了利用基因工程技术的方法，通过构建融合了LL-37编码基因的重组表达载体和重组工程菌来表达LL-37，但是目前的方法仍然存在发酵耗时较长的问题。

发明内容

本发明的目的是要提供一种能高效表达LL-37多肽的多拷贝重组表达载体及应用。本发明目的是让重组质粒能够在SMD1168H毕赤酵母中高效表达，从而实现LL-37在真核系统中的分泌表达，简化工序，提高表达量及避免了大肠杆菌会带来的安全性问题。

为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的：

本发明一种能高效表达LL-37多肽的多拷贝重组表达载体，以PPICZα为基础载体插入目的片段得到重组表达载体，所述的重组表达载体PPICZα载体序列包括信号肽α因子、拷贝的LL-37序列。

进一步，所述的能高效表达LL-37多肽的多拷贝重组表达载体，其特征在于：所述目的片段插入在PPICZα的BgI II和BamH I的限制性酶切位点之间。

本发明所述的重组毕赤酵母，采用以PPICZα为基础载体插入目的片段得到重组表达载体转化毕赤酵母感受态细胞，得到重组毕赤酵母。

进一步，所述重组毕赤酵母的原始菌株包括毕赤酵母SMD1168H。

进一步，所述重组毕赤酵母的构建方法包括以下步骤：

S1：配置培养基：

YPD的配制：胰蛋白胨、酵母提取物用ddH₂O溶解并定容，121℃灭菌20min；使用前再加入115℃灭菌15min葡萄糖溶液，固体则加热后再加琼脂粉；

YPDS的配制：胰蛋白胨、酵母提取物、山梨醇用ddH₂O溶解并定容，将溶液加热后加入琼脂粉，121℃灭菌20min；使用前再加入115℃灭菌15min的葡萄糖溶液；

山梨醇：山梨醇用ddH₂O溶解并定容，过滤除菌或者121℃灭菌20min；

S2：制备感受态细胞：挑取毕赤酵母单菌落用YPD培养基培养至OD值0.4-0.6之间，离心加纯净水洗涤后再加纯水涡旋混匀，再离心弃上清，再加灭菌山梨醇混合离心一次，最后加入1ml山梨醇，制备感受态细胞；