[发明专利]一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽及其检测蛇毒类凝血酶的种属来源、含量的方法与应用

权利要求书

1.一种矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽，其特征在于，其氨基酸序列为EAYNGLPAK。

2.一种检测蛇毒类凝血酶的属来源的方法，其特征在于，采用如下步骤：

（1）在待测样品中加入胰蛋白酶进行酶解预处理，取上清液；具体操作为：取待测样品20 mg，然后加入浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至100 mL，摇匀，得到溶液；量取1mL上述溶液，加入浓度为10 mg/mL的胰蛋白酶溶液10 μL，在37 ℃下反应4小时，离心取上清液；

（2）将所述上清液分别注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，以质荷比双电荷481.9→485.2作为定性离子对，质荷比双电荷481.9→315.2作为定量离子对所述上清液进行检测；

所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：Thermo Hypersil GOLDC18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→2 min，流动相A 90%；2→6 min，流动相A 90%→60%；6.1→8 min，流动相A 30%；8.1→10 min，流动相A 90%；

所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500 ℃；离子化电压5.5 kV；碰撞室出口电压10V；入口电压EP 10 V；碰撞能量CE均为20 V，去簇电压DP为80 V；

（3）若步骤（2）检测得到的色谱图中呈现与对照特征多肽色谱保留时间一致的色谱峰，则表明待测样品来源于矛头蝮蛇；反之，则为非矛头蝮蛇来源；所述对照特征多肽的氨基酸序列为EAYNGLPAK。

3.一种检测蛇毒类凝血酶含量的方法，其特征在于，采用如下步骤：

（i）取权利要求1所述的矛头蝮蛇类凝血酶特征多肽，溶解并稀释制成系列浓度对照品溶液；

（ii）以权利要求2所述的检测蛇毒类凝血酶属来源的方法中检测到的来源于矛头蝮蛇的样品为待测对象，在待测对象中加入胰蛋白酶进行酶解预处理，具体操作为：取待测样品20 mg，然后加入浓度为25 mmol/L的碳酸氢铵溶液定容至100 mL，摇匀，得到溶液；量取1mL上述溶液，加入浓度为10 mg/mL的胰蛋白酶溶液10 μL，在37 ℃下反应4小时，离心取上清液作为供试品溶液；将供试品溶液注入液相色谱-质谱仪，采用电喷雾正离子模式进行多反应监测，以质荷比双电荷481.9→485.2作为定性离子对，质荷比双电荷481.9→315.2作为定量离子对所述上清液进行检测；

所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，液相条件为：Thermo Hypersil GOLDC18色谱柱（100 mm×2.1 mm，3 μm）；柱温：40 ℃；进样量：10 μL；流速：0.3 mL/min；流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序：0→2 min，流动相A 90%；2→6 min，流动相A 90%→60%；6.1→8 min，流动相A 30%；8.1→10 min，流动相A 90%；

所述液相色谱-质谱仪中液相和质谱检测条件中，质谱条件为：电喷雾离子源，正离子扫描模式，多反应监测；涡旋离子喷雾温度500 ℃；离子化电压5.5 kV；碰撞室出口电压10V；入口电压EP 10 V；碰撞能量CE均为20 V，去簇电压DP为80 V；

（ⅲ）提取质荷比双电荷为481.9→315.2的色谱图，以步骤（i）所述系列浓度对照品溶液中特征多肽的浓度为横坐标，以步骤（ii）中色谱图对应的峰面积为纵坐标，计算线性回归方程，从回归方程计算供试品溶液浓度，进而计算待测对象中类凝血酶含量。

4.根据权利要求3所述的检测蛇毒类凝血酶含量的方法，其特征在于，步骤（ⅲ）中，所述线性回归方程的r0.99。