[发明专利]一种生产人参皂苷Rg1的方法及其专用的工程菌

说明书

本发明公开了一种生产人参皂苷Rg1的方法及其专用的工程菌。本发明通过将磷酸葡萄糖变位酶1的编码基因、α‑磷酸葡萄糖变位酶的编码基因、尿苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶的编码基因、拟南芥UDP‑葡萄糖脱氢酶1的编码基因、拟南芥UDP‑葡萄糖醛酸脱羧酶3的编码基因和人参UDP‑糖基转移酶101的编码基因导入生产PPT的菌株BY‑PPD‑PPT，得到重组酵母菌Rg1‑XM。重组酵母菌Rg1‑XM可以生产人参皂苷Rg1，具有较好的工业化应用前景。本发明具有重要的应用价值。

本申请是申请号为202010095703.2、申请日为2020年2月17日、发明创造名称为“Pn3-32-15蛋白及其编码基因在生产三七皂昔Rl中的应用”的分案申请。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种生产人参皂苷Rg1的方法及其专用的工程菌。

背景技术

三七皂苷R1(化学式如式(I)所示)为达玛烷型三萜皂苷类化合物，主要分布于五加科植物人参、三七、西洋参等植物中，具有神经保护、抗炎、抗凋亡、活血化瘀等作用，是极具药用价值的化学物质。三七皂苷R1主要从三七中分离提取，但分离提取方法有较多的缺点，如含量低、差异大、产品纯化难、植物生长周期长、对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。

目前，利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(Parayil Kumaran Ajikumar et al.，2010，Science，330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量 (Effendi Leonard et al.，2010，PNAS，107(31):13654-13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到25g/L(Paddon CJ et al.，2013，Nature，2013，496:528-532)。目前国内在青蒿素、紫杉醇、人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方面均有相关研究。

清晰的天然药物生物合成过程是应用合成生物学技术创建人工细胞工厂发酵生产目标化合物的前提。目前，在人参皂苷的生物合成途径研究方面已有相关进展，包括人参皂苷合成途径中的一些关键酶，如催化类异戊二烯途径朝向固醇和三萜皂苷的角鲨烯合酶(Squalene synthase，SS)，催化2，3-氧化角鲨烯生成的角鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase， SE)，催化达玛烯二醇生成的达玛烯二醇合成酶(DS)，还有负责羟基化的细胞色素P450酶等，但三七皂苷R1的合成途径尚未完全挖掘。

发明内容

本发明的目的是生产人参皂苷Rg1。

本发明提供了一种蛋白质，来源于三七，命名为Pn3-32-i5蛋白，可为如下a1)或a2) 或a3)或a4)：

a1)氨基酸序列是SEQ ID NO：5所示的蛋白质；

a2)在SEQ ID NO：5所示的蛋白质的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质；

a3)将a1)或a2)所示的蛋白质经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的具有三七皂苷R1合成酶活性的蛋白质；

a4)与a1)或a2)所示的蛋白质具有80％或80％以上同一性，来源于三七且具有三七皂苷R1合成酶活性的蛋白质。

其中，SEQ ID NO：5由446个氨基酸残基组成。

为了使蛋白质便于纯化和检测，可在由SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列组成的Pn3-32-i5蛋白的氨基末端或羧基末端连接上如表5所示的标签。

表5.标签的序列