[发明专利]一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用

说明书

本发明提供一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用。为了解决现有技术中的环瓜氨酸肽的环状结构处的二硫键容易断开，导致瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基线性抗原表位暴露而被其他抗体识别，从而出现假阳性的问题，本发明提供的环瓜氨酸肽，瓜氨酸残基一端的肽段和瓜氨酸残基另一端的肽段之间通过碳‑硫键连接成环。碳‑硫键比天然环瓜氨酸中两个半胱氨酸C之间形成的二硫键键长更短，键能更大，不易断开，降低了瓜氨酸抗体识别关键区外的氨基酸残基线性抗原表位而被其他抗体识别的概率，降低了假阳性，提高了抗环瓜氨酸肽抗体在RA疾病诊断中的临床检测特异性。

技术领域

本发明涉及生物学检测技术领域，具体涉及一种环瓜氨酸肽、含该肽的抗原、试剂、试剂盒及应用。

背景技术

类风湿性关节炎(Rheumatoid Arthritis，RA)是一种病因未明的慢性、以炎性滑膜炎为主的系统性疾病，全世界大约有1％的人罹患此病，其中75％为女性。类风湿关节炎多见于中年女性，在我国的患病率约为0.32％～0.36％。RA能引起关节的疼痛、僵直及肿胀，在发病2年内即可能出现不可逆的骨关节损伤，最后将导致关节强直、畸形和功能丧失，并可引起多种并发症。

长期以来人们期望能找到一些检验方法以助诊断，也已取得了一定的进展。

检测类风湿因子(RF)是最常用的一种诊断方法，已被纳入1982年美国风湿病协会分类标准，分为IgG、IgA、IgM、IgE型RF四种亚型。用于RF检测的最常用的方法是乳胶凝集法，该法方便、易行、成本低，但仅能检出IgM型RF(见于70％以上RF患者)，缺乏疾病特异性，且因乳胶法仅能检测部分IgM型RF，其他类型RF及部分IgM型RF易逃脱检验导致假阴性。用ELISA法检测RF可分别检出IgG、IgA、IgM、IgE型，能弥补乳胶凝集法之不足。

近年来，逐步发现RA患者血清中的抗核周因子(Antiperipheral Factor，APF)、抗角蛋白抗体(Antikeratin Antibody，AKA)以及抗丝集蛋白抗体(AntifilaggrinAntibody，AFA)对RA的诊断具有高度的特异性。研究发现这些靶抗原在化学结构上具有相关性，他们识别的抗原决定簇中都含有瓜氨酸残基。瓜氨酸是一种稀有氨基酸，来源于翻译后酶修饰的精氨酸残基。

最初使用的环瓜氨酸肽(CCP)抗原是来源于丝聚蛋白的含19个氨基酸的直链线性瓜氨酸肽段，然而研究发现用直链线性瓜氨酸肽段为底物，用ELISA法来检测抗环瓜氨酸肽抗体常会导致失败，原因是由于此肽段不能吸附于聚苯乙烯上。后来，为了提高瓜氨酸肽链的抗原活性，1985年，荷兰学者Schellekens GA将上述由19个氨基酸残基组成的一条瓜氨酸肽链中的两个丝氨酸替换成半胱氨酸，并使半胱氨酸环化形成β-转角结构相似的二硫键，而成为环瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide，CCP)。2000年，Schellekens GA根据filaggrin的Cdna序列合成了一条含瓜氨酸的环肽(即环瓜氨酸肽)，可用于ELISA检测，并成功地在RA患者血清中检出了anti-CCP，而且发现采用环瓜氨酸肽为抗原，用ELISA法检测RA患者血清中的抗环瓜氨酸肽抗体，其敏感性和特异性比用直链线性的瓜氨酸肽作为抗原检测时有明显的提高。2001年，国内用已知cDNA序列(人工合成)的环瓜氨酸肽是一条人工合成的含有21个氨基酸的多肽，其氨基酸序列为：HQCHQESTXGRSRGRCGRSGS，通过两个天然的半光氨酸形成二硫键成环。