[发明专利]一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法

说明书

本发明提供了一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法，涉及生命科学技术领域。本发明所述方法通过使用Hdcok对得到并通过结构比对与MD模拟筛选出最佳复合体模型、参照定向进化实验对复合体模型进行特定突变、每个结构执行1μs时长的全原子分子动力学模拟和对每段轨迹进行能量计算机氢键盐桥分析，得出进化路径的能量学和结构动力学细节。利用本发明所述方法，成功把一个噬菌体RNAP从识别其原始启动子切换到另一个启动子上。

技术领域

本发明属于生命科学技术领域，具体涉及一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法。

背景技术

近年来，实验室定向进化技术在生物分子系统的功能设计或再设计方面取得了重大进展，特别是在蛋白质酶的活性和特异性方面进展喜人。在实验室定向进化中，序列突变和重组被密集地推动，然后通过高通量筛选或选择来锁定特定的蛋白质功能。例如，在噬菌体辅助的连续进化(PACE)中，具有修改过的生命周期的噬菌体基因，被用来在细菌宿主细胞之间转移进化，以促进快速复制的噬菌体种群，其中包含对某些有利的酶活性的基因突变。随着定向进化技术的进步，不仅可以设计出具有某些功能的单个蛋白酶，而且还可以对路径或蛋白相互作用网络进行调控或重新布线。同时，基于蛋白质的分子结构和生化特性的蛋白质功能的合理设计一直是人们追求的目标，这通常需要对蛋白质序列或构象演化的高维空间中的最优解进行物理理解和计算探索。由于生物大分子或酶是由高度复杂的结构-功能关系演变而来的内在复杂系统，直接的物理或理性方法通常具有高度的挑战性，无法得出这种复杂系统的最优解。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种单体聚合酶定向进化识别不同启动子的模拟预测方法，发现了潜在的物理机制，有望帮助知识/数据学习或合理地重新设计蛋白酶的结构-功能，以实现重新连接的启动子识别功能。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了一种基于实验室定向进化的病毒RNA聚合酶识别不同启动子的方法，包括以下步骤：(1)模拟野生病毒RNA聚合酶的游离结构，将所述游离结构与含原始识别启动子的dsDNA对接，构建得到封闭启动复合物；

(2)对所述封闭启动复合物进行全原子分子动力学模拟，筛选最佳复合物模型；

(3)参照定向进化实验，对所述最佳复合物模型进行特定突变，得若干不同的RNA聚合酶/启动子复合物；

(4)对所述RNA聚合酶/启动子复合物进行全原子分子动力学模拟，对得到的模拟轨迹进行数据分析，得进化路径的能量学和结构动力学数据，从而得到识别目标启动子的病毒RNA聚合酶。

优选的，所述病毒包括噬菌体。

优选的，步骤(1)所述原始识别启动子包括T7启动子，所述dsDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

优选的，步骤(1)所述对接后还包括筛选构建得到所述封闭启动复合物；

所述筛选包括使用基于FFT的全局对接程序对HDOCK服务器中的推定结合模式进行全局采样，使用改进的基于形状的成对评分功能，选择得分最好的前10个结构模型，然后将所述前10个结构模型与原始识别启动子RNA聚合酶开放启动复合物进行比对，筛选出与原始识别启动子RNA聚合酶具有相似DNA启动子定位的若干结构。

优选的，所述全原子分子动力学模拟的每次模拟时长为1微妙。

优选的，步骤(3)所述特定突变包括利用AmberTools中的Tleap方法改变蛋白质中的氨基酸，将原始识别启动子中的DNA碱基对突变为目标识别启动子中的碱基对，并保持核酸骨架不变。

优选的，在所述特定突变后还包括对得到的突变产物进行能量最小化处理，得到若干不同的RNA聚合酶/启动子复合物。

优选的，步骤(4)所述数据分析包括能量计算和氢键盐桥分析。