[发明专利]一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法

权利要求书

1.一种人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤（1）、将包含弓形虫重组抗原的菌体在破碎缓冲液A中重悬，每1 g菌体用15 mL破碎缓冲液A；

步骤（2）、将步骤（1）中得到的菌液用超声破碎仪破菌，离心并收集上清液；

步骤（3）、将步骤（2）中得到的上清液上样至镍柱，用破碎缓冲液A冲洗柱子，洗杂缓冲液B洗脱杂蛋白，用解离缓冲液C解离目的蛋白，得到含有变性的弓形虫重组抗原的解离液；

步骤（4）、将步骤（3）中得到的解离液冰上搅拌，取等体积的复性缓冲液D分三次加入解离液中，冰上搅拌24 h；搅拌结束后，按1:100的体积比透析至上样缓冲液E，透析两次，得到含有复性弓形虫重组抗原的复性液；

步骤（5）、将步骤（4）中得到的复性液经过阴离子交换柱，上样缓冲液E冲洗柱子，解离缓冲液F解离目的蛋白，得到包含弓形虫重组抗原的溶液；

步骤（6）、将步骤（5）中得到的溶液透析至上样缓冲液E；最终得到包含弓形虫重组抗原SAG1的溶液。

2.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述破碎缓冲液A中包括20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，20 mM imidazole，pH8.0。

3.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述洗杂缓冲液B中包括20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，75 mMimidazole，pH8.0。

4.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述解离缓冲液C中包括20 mMTris，300 mMNaCl，4 M Urea，500 mM imidazole，pH8.0。

5.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述复性缓冲液D中包括20 mMTris，300 mMNaCl，5% glycerol，pH8.0。

6.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述上样缓冲液E中包括20 mMTris，pH8.0。

7.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述解离缓冲液F中包括20 mMTris，500 mMNaCl，pH8.0。

8.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（2）中，超声破碎的功率200W，超声破碎的时间为20 min；离心频率15000 rpm，离心时间30min，离心温度4℃。

9.根据权利要求1所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（1）中，包含弓形虫重组抗原的菌体制备方法，包括以下步骤：

步骤（11）、将pET28a-SAG1重组质粒转化至大肠杆菌感受态，涂布到含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB固体培养基上，37 ℃孵育16 h后挑取转化成功的阳性菌落，接种至含卡那霉素50 μg/mL和氯霉素34 μg/mL的LB液体培养基，37 ℃震荡培养8 h，取8 mL菌液接种至800 mL LB液体培养基，37 ℃震荡培养3 h，OD₆₀₀达到0.8-1时，添加IPTG至终浓度1 mM，37℃继续震荡培养4 h，5000 rpm离心5 min收集沉淀，得到包含弓形虫重组抗原的菌体。

10.根据权利要求9所述的人源弓形虫重组抗原蛋白的制备方法，其特征在于，所述步骤（11）中的大肠杆菌感受态为Rosetta(DE3)，含氯霉素抗性，可表达稀有密码子。