[发明专利]miRNA作为生物标记物在制备骨肉瘤检测制剂中的应用

说明书

本发明公开了miRNA在制备骨肉瘤检测制剂中的应用，所述miRNA为hsa‑miR‑34a、hsa‑miR‑1270、hsa‑miR‑154、hsa‑miR‑329中的一条或几条。本发明发现hsa‑miR‑34a，hsa‑miR‑1270，hsa‑miR‑154，hsa‑miR‑329在骨肉瘤患者的唾液外泌体中显著上调，且与骨肉癌组织具有较高的一致性，说明这四条miRNA中的一条或几条可以作为骨肉瘤标志物，应用于制备骨肉瘤检测制剂中。

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，更具体地，本发明涉及多条miRNA作为生物标记物在制备非疾病诊断方法的骨肉瘤检测制剂中的应用。

背景技术

骨肉瘤是儿童及成人中最常见的恶性骨肿瘤，在原发性骨肿瘤中，骨肉瘤的发病率仅次于浆细胞骨髓瘤，居第2位，好发于10-25岁青年，男女患者比例约为1.5:1。骨肉瘤的恶性程度很高，生长非常迅速，转移早，侵袭性强，在临床上作出诊断时已有80％左右的患者发生了肺部或其他部位的转移。既往骨肉瘤患者的预后极差，5年生存率仅有20％左右，尽管近年来外科手术和化疗方面取得了长足的进展，但骨肉瘤患者的5年生存率至今仍徘徊在65％左右，多数患者最终仍然死于骨肉瘤的局部复发或远处转移。

由于骨肉瘤具有恶性程度高、生长迅速、侵袭力强、转移早等肿瘤学特征，所以绝大多数患者就诊时已经是癌症晚期，而研究表明早期诊断及治疗可使骨肉瘤患者的生存率及预后效果提高4-5倍。因此，针对骨肉瘤的早期诊断，早期筛查，将骨肉瘤患者的治疗窗口提前，改善患者的预后，及时评价放化疗的效果，针对骨肉瘤患者的个性化医疗及用药，尤为重要。

目前骨肉瘤的筛查或者诊断依赖于影像学和组织病理学检测，影像学由于自身技术特点只能检测到生长到一定程度的肿瘤，而病理学需要采用外科手术穿刺活检方法从患者身体获取肿瘤组织，不但操作技术难度大，成本高，效率低而且依从性较差，无法大批量进行筛查，而且受到医生技术水平及患者身体状况等诸多因素影响，不能用于早期筛查和临床诊断。

miRNA是具有在转录后水平调控基因表达功能的非编码小分子RNA，长度约18-24nt，参与细胞分裂增殖、分化与发育，以及代谢等许多重要的生物过程，在生物种属之间具有高度的保守性、时序性以及组织特异性。它位于基因内含子中，成熟的miRNA进入RNA诱导的基因沉默复合物(RISC)中，形成非对称性复合物。RISC中成熟的miRNA链可与其靶向mRNA3’非翻译区特异性结合，从而降解靶mRNA，阻断蛋白合成，调控基因的表达。

miRNA作为一种在某些肿瘤中异常表达的非编码的小RNA，参与许多肿瘤的发生发展的相关基因的调控，在这一过程中发挥着十分关键的作用，且其即使在大量核酶存在的情况下依旧十分稳定，在各种体液中表达丰富，可以作为肿瘤诊断和预后判断的生物标志物。在未来临床治疗中，miRNA不仅可以成为新的疾病早期诊断和疾病进程相关的标记物，而且也有望通过改变miRNA的表达或者其靶基因的表达治疗疾病。寻找和鉴定与疾病发生相关的miRNA及其靶基因为miRNA的临床治疗提供基础。

基于以上原因，发现具有高灵敏度及特异性的检测骨肉瘤的生物标志物miRNA，并建立无创早期筛查方法及评价放化疗治疗效果的检测方法是目前研究的热点也是当务之急。而液态活检技术(Liquid Biopsy)正好可以解决目前这一痛点，可以很好的解决上述问题。目前主要是针对血液中的DNA片段、血液中循环肿瘤细胞、以及微小RNA通过高通量测序检测基因突变。

然而，血液样本尽管包含了全身状况的众多信息，但通过提取血液中的miRNA来进行液体活检，仍有一些固有的缺陷：第一，血液采集具有侵袭性，引起患者不适；第二，这种直接检测血液中裸露DNA或miRNA也会造成不同程度的损失和降解；第三，血液中成分复杂，来源多样，信息斑驳，在检测分析的过程中可能会引起非特异性及受到流体动力学作用的干扰；第四，血液有易凝结的特点，需要采取抗凝处理才能进行下一步的检验，而抗凝处理本身有可能会对检验结果造成一定的影响；第五，血液中的大量细胞具有数秒至数周或一个月以上的半衰期，也可能对分析结果产生影响。