[发明专利]一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，其特征在于，包括两对巢式PCR引物，其中一对巢式PCR引物的正向引物P-F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P-R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示，另一对巢式PCR引物的正向引物P-F2的核苷酸序列如SEQNO:3所示，反向引物P-R2的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。

2.根据权利要求1所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，其特征在于，还包括反转录及PCR扩增体系所用试剂，所述反转录及PCR扩增体系所用试剂包括2×Reaction Mix、RT/Taq enzyme和Nuclease-free ddH₂O。

3.根据权利要求1所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测试剂盒，其特征在于，还包括荧光定量PCR反应体系所用试剂，所述荧光定量PCR反应体系所用试剂包括2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix和ddH₂O。

4.一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)使用一步法逆转录及PCR扩增直接对待测样品进行逆转录及PCR扩增，所用引物为一对巢式PCR引物，其正向引物P-F1的核苷酸序列如SEQ NO:1所示，反向引物P-R1的核苷酸序列如SEQ NO:2所示；(2)将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物作为模板，进行荧光定量PCR反应检测HBV pgRNA的含量，所用引物为另一对巢式PCR引物，其正向引物P-F2的核苷酸序列如SEQ NO:3所示，反向引物P-R2的核苷酸序列如SEQ NO:4所示。

5.根据权利要求4所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述逆转录及PCR扩增的反应体系为2×Reaction Mix、正向引物P-F1、反向引物P-R1、RT/Taq enzyme、待测样品和Nuclease-free ddH₂O。

6.根据权利要求5所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述一步法逆转录及PCR扩增的具体步骤为：将所述逆转录及PCR扩增的反应体系立即置于-70℃冰箱2分钟，再加入1μL矿物油，3000rpm离心2分钟，立即进行如下PCR反应，50℃逆转录60min，循环1次，95℃预变性3min，循环1次，95℃变性15sec后60℃退火、延伸2min，循环20次，最后保持4℃。

7.根据权利要求4所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，在一步法逆转录及PCR扩增结束后，将一步法逆转录及PCR扩增所得到的产物用ddH₂O进行300-500倍稀释，立即进行后续荧光定量PCR反应。

8.根据权利要求7所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应体系为2×ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix、正向引物P-F2、反向引物P-R2、稀释后的产物和ddH₂O。

9.根据权利要求8所述一种微量样品中HBV pgRNA的高区分度检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应的具体步骤为：95℃预变性30sec，循环1次，95℃变性10sec后60℃退火、延伸30sec，循环40次。