[发明专利]大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A的应用

说明书

本发明提供了大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶(AHAS)催化亚基基因VdILV2A的应用，属于功能基因技术领域。本发明以敲除突变体ΔVdILV2A和互补突变体为实验对象，分别从致病性以及支链氨基酸生物合成等方面分析VdILV2A的作用。结果表明ΔVdILV2A致病力显著下降；维管束变褐明显减弱；在玻璃纸上穿透能力延迟；并且在根和茎中的定殖都受到阻碍。VdILV2A也是支链氨基酸合成的必需基因，VdILV2A参与亮基酸合成。又鉴于AHAS是除草剂的作用靶点，VdILV2A可在防治棉花黄萎病中进行应用。因此本发明对大丽轮枝菌的防控和开发新型杀菌剂具有重要的理论价值，对促进棉花安全生产具有重要的现实意义。

技术领域

本发明属于功能基因技术领域，具体涉及大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基基因VdILV2A的应用。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)，属于半知菌亚门轮枝菌属真菌。大丽轮枝菌的寄主范围极广，国外报道可为害38科660种植物，其中农作物184种，杂草153种。我国经鉴定，寄主植物至少20科80种，大田作物包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、马铃薯、甜瓜、西瓜、黄瓜、花生、菜豆、绿豆、大豆、芝麻、甜菜等，一般禾本科作物如水稻、麦类、玉米、谷子、高梁等不受侵害。大丽轮枝菌是引起棉花黄萎病的主要病菌，产生致病毒素和导管堵塞是致病的主要致病机制。大丽轮枝菌所产轮枝菌素(VD-toxin)是致萎的主要原因。导管堵塞的原因:一是菌丝及分生孢子大量繁殖。二是病菌侵入寄主后，刺激邻近的薄壁细胞产生凝胶体、树胶和侵填体。三是病菌侵入后产生果胶酶，分解细胞和细胞壁中的胶状物质和果胶物质，引起组织解体，从而堵塞导管。

乙酰乳酸合成酶(Acetohydroxyacid synthase，简称AHAS或ALS，EC 2.2.1.6)是植物和微生物体内催化缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸3种支链氨基酸支链氨基酸生物合成途径中的第一个关键酶。由于哺乳动物中缺乏该酶，以此酶为靶向开发的抑制剂，如磺酰脲类、咪唑啉酮类、嘧啶氧苯甲酸类和三唑嘧啶磺酰胺类除草剂对哺乳动物具有生物安全性，因此，有关AHAS的研究更多的集中在其生化结构方面。

AHAS由催化亚基(CSU)和调节亚基(RSU)组成，在缺乏RSU的条件下，AHAS酶活性降至全酶活性的15％以下，RSU对CSU的催化活性具有激活作用，因此实现AHAS全酶活性2个亚基都必不可少。CSU序列在大多数AHAS中都是保守的，RSU序列在不同AHAS间保守性却很低，但是RSU都有保守的包含支链氨基酸结合位点的ACT结构域，该结构域与代谢、信号转导和溶质运输等功能有关，是RSU激活CSU催化活性的重要元件。RSU的ACT结构域不仅能够激活同源的催化亚基，也能激活来自不同物种(植物、真菌和细菌)的异源催化亚基。AHAS的一个重要特征是反馈抑制，即支链氨基酸产物能够负调控全酶活性。

由于缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸3种支链氨基酸的简写分别是I、L、V，通常将细菌和真菌中表达AHAS的基因表示为ILVx，如将真菌AHAS催化亚基基因命名为ILV2；大肠杆菌表达AHASⅠ、AHASⅡ和AHASⅢ的基因分别表示为ilvBN、ilvGM和ilvIH。研究发现，致病真菌的AHAS不仅参与支链氨基酸合成，也与病原菌致病力密切相关。白色念珠(Candidaalbicans)的CSU基因ILV2敲除导致病原菌生存率减弱、致病力显著下降(Kingsbury,2010)；禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)的CSU基因FgILV2敲除导致气生菌丝和红色素减少，ΔFgIlV2突变体完全丧失致病性(Liu et al.,2015)；稻瘟病菌MoIlV2亚细胞定位于线粒体上，MoIlV2基因敲除导致稻瘟菌不产生分生孢子梗和分生孢子、附着胞穿透下降和致病力显著下降(Du et al.,2013)。然而目前大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶调节亚基基因(VDAG_09113，命名为VdILV2A)的功能尚未明确。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种大丽轮枝菌乙酰乳酸合成酶催化亚基VdILV2A基因的新应用，明确VdILV2A基因在大丽轮枝菌的致病机制的作用，为防治大丽轮枝菌以及开发新型杀菌剂提供依据。