[发明专利]一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种可变剪接报告质粒，其特征在于，其是以包含E1-Intron1-E2-Intron2-E3的质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒，其特征在于，以待验证基因的内含子替代权利要求1所述的可变剪接报告质粒的Intron1或Intron2，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒即用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒。

3.一种可变剪接报告质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以质粒pCDNA3.1-EGFP-C为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，在E1与E2之间插入内含子序列Intron1，E2与E3之间插入内含子序列Intron2，即得可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，Intron1序列如SEQ IDNO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示。

4.一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：以质粒pCDNA3.1-EGFP-C为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，在E1与E2之间插入内含子序列Intron1，E2与E3之间插入内含子序列Intron2，即得可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示；

以待验证基因的内含子替代可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS的Intron1或Intron2，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒即用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒。

5.一种用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)以质粒pCDNA3.1-EGFP-C为基础，将EGFP基因序列分为3段并分别命名为E1、E2、E3，E1序列如SEQ ID NO.1所示，E2序列如SEQ ID NO.2所示，E3序列如SEQ ID NO.3所示，在E1与E2之间插入内含子序列Intron1，E2与E3之间插入内含子序列Intron2，即得可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS，Intron1与Intron2分别具有5’剪切位点、分支位点和3’剪切位点，Intron1序列如SEQ ID NO.4所示，Intron2序列如SEQ ID NO.5所示；

2)以待验证基因的内含子替代可变剪接报告质粒pCDNA3.1-EGFP-AS的Intron1或Intron2，形成包含待验证基因内含子的minigene质粒即用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响的质粒；

3)以minigene质粒转染细胞，后通过荧光显微镜观察转染的细胞是否表达完整的荧光蛋白，有荧光表明待验证基因的内含子被正确剪接掉，若无荧光则表明待验证基因的内含子发生异常剪接；同时结合转染细胞的EGFP扩增测序进一步验证转染细胞内待验证基因的内含子是否被正确剪接。

6.权利要求2所述的质粒在用于验证人类基因内含子变异对基因剪接影响中的应用，其特征在于，包括如下步骤：以minigene质粒转染细胞，后通过荧光显微镜观察转染的细胞是否表达完整的荧光蛋白，有荧光表明待验证基因的内含子被正确剪接掉，若无荧光则表明待验证基因的内含子发生异常剪接；同时结合转染细胞的EGFP扩增测序进一步验证转染细胞内待验证基因的内含子是否被正确剪接。