[发明专利]一种用于检测FLT3基因突变的引物、探针及试剂盒

说明书

本发明公开了一种用于检测FLT3基因突变的引物、探针及试剂盒，属于基因检测领域。本发明用于检测FLT3基因突变的引物、探针包括针对性检测FLT3基因D835位点突变和FLT3基因I836位点突变的引物、探针。本发明的引物及试剂盒依托于数字PCR检测技术，与目前其他检测FLT3突变的技术相比，简化了检测的步骤，具有检测过程简单高效、绝对定量、灵敏度高等优点。本发明为携带FLT3基因D835或I836del突变的AML患者进行辅助诊断和临床治疗效果监测提供有力的技术支持，有着广阔的应用前景和产业化前景。

技术领域

本发明属于基因检测领域，具体涉及一种用于检测FLT3基因突变的引物、探针及试剂盒。

背景技术

FLT3基因位于染色体13q12.2，有24个外显子，编码的蛋白属于III型受体酪氨酸激酶家族成员之一,全称是FMS样酪氨酸激酶3（FMS-like tyrosine kinase 3），在造血细胞存活、增殖和分化中起重要作用。FLT3蛋白由位于细胞外区域的免疫球蛋白样细胞外结构域、跨膜结构域、近膜结构域（JMD）、酪氨酸激酶结构域中断（TKD）和小的C末端域等5个结构域组成。据2015年中国肿瘤统计报告，中国白血病发病人数为75300/年，死亡人数为53400/年，其中成人急性髓系白血病(AML)约占成人白血病的65%，儿童AML约占儿童白血病的25%。在临床上，FLT3基因的激活突变是急性髓细胞性白血病（AML）患者中是最常见的基因改变和预后不良因素。在约三分之一的AML患者中存在FLT3基因的突变，其中最常见突变的两种形式是内部串联重复(ITD)以及酪氨酸激酶结构域(TKD)中的点突变，而后者最主要的突变位点是D835和I836。

近年来，AML的治疗效果随化疗方案的不断改进和分子靶向药物的开发而取得很大进展，在国内靶向治疗药物gilteritinib（吉瑞替尼）通过中国国家药品监督管理局（NMPA）审批，用于治疗FLT3突变阳性的复发或难治性急性髓系白血病。但是微小残留病变（minimal residual disease,MRD）仍然是影响AML预后的一大难题。微小残留病变是指白血病诱导化疗完全缓解后，在体内残留少量白血病细胞的状态。MRD作为评价预后的敏感指标，在患者经过治疗得到完全缓解后，怎样准确检出混杂在正常造血细胞中的量的白血病细胞是问题的关键。而白血病细胞的残留量，取决于检测方法的灵敏性。FLT3 D835和I836突变在AML患者中，其突变率可以成为MRD的重要指标之一。所以，在FLT3靶向的治疗过程中，FLT3 D835和I836突变的持续跟踪检测对AML病人预测疾病的进展、指导的药物治疗选择和预后有着重要的意义。

目前针对FLT3-TKD突变常用的检测技术主要有限制性内切酶+PCR电泳法、传统的Sanger测序和二代测序法。但这些检测方法均存在一些缺点。比如限制性内切酶法是无法做到100％有效的识别野生型DNA进行切割，容易造成检测假阳性结果，降低试剂盒使用的准确性，特别是样品中的突变率较低时，使用限制性内切酶切割来判断样品中是否存在突变的准确率和灵敏度都很低；传统的Sanger测序检测通量低，而且检测的灵敏度也不高：1％~10％。而NGS的检测虽然通量大，检测灵敏度相对毛细管电泳法有很大提升，但NGS方法成本昂贵，数据分析复杂耗时长，灵敏度只有1%左右。检测结果的准确性直接影响临床疾病的诊断和治疗效果的判断，因此本领域需要一种能够更加灵敏、简便、准确地检测FLT3D835和I836突变的方法。数字PCR (digital PCR)是近年来新出现的技术，它的原理是将一个标准PCR反应分配到大量微小的反应器中，在每个反应器中包含或不包含一个或多个拷贝的目标分子( DNA模板) ，实现“单分子模板PCR扩增”，PCR扩增后，经生物芯片分析仪进行荧光强度检测。与阴性微滴相比，包含核酸分子的阳性微滴的荧光信号强度增加，根据泊松分布的原理，通过阳性微滴比例计算目标核酸分子的绝对拷贝数。整个过程不依赖于标准曲线和参照样本，直接检测样本获得目标序列的拷贝数。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种用于检测FLT3基因突变的引物、探针及试剂盒，该检测试剂盒简单高效、绝对定量、灵敏度高。