[发明专利]产乙偶姻的大肠杆菌工程菌及构建方法与在全细胞催化生产乙偶姻的应用

权利要求书

1.产乙偶姻的大肠杆菌工程菌，其构建方法为通过共表达α-乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、乳酸脱氢酶和NADH氧化酶，得到产乙偶姻的大肠杆菌工程菌；

构建大肠杆菌工程菌中使用的宿主菌为突变型大肠杆菌BL-2，

所述突变型大肠杆菌BL-2为将大肠杆菌Escherichia coli BL21(DE3)中乙酸生成途径的磷酸乙酰转移酶和乙酸裂解酶编码基因pta-ackA和丙酮酸氧化酶编码基因poxB敲除后得到；

所述α-乙酰乳酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示；

所述α-乙酰乳酸脱羧酶的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示；

所述乳酸脱氢酶的氨基酸序列为SEQ ID No.3；

所述NADH氧化酶的氨基酸序列为SEQ ID No.4。

2.根据权利要求1所述的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌，其特征在于所述共表达的方法为：利用重组表达载体向所述宿主菌中导入所述α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS、α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC、乳酸脱氢酶的编码基因ldh和NADH氧化酶的编码基因nox；

所述重组表达载体为pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox；

所述α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示；

所述α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；

所述S2的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示；

所述乳酸脱氢酶的编码基因ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；

所述NADH氧化酶的编码基因nox的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示；

所述重组表达载体的基本载体是pET28a。

3.权利要求1或2的产乙偶姻的大肠杆菌工程菌的构建方法，其特征在于包括如下步骤：

1)以引物LDH-F为上游引物，以引物LDH-R为下游引物，以载体pET28a-ldh为模板，经PCR，制备含乳酸脱氢酶的编码基因ldh的片段ldh-1；

以引物NOX-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，以载体pET28a-nox为模板，经PCR，制备含NADH氧化酶的编码基因nox的片段nox-1；

以引物LDH-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，利用片段ldh-1和nox-1，经PCR，制备融合片段ldh-nox；

2)以引物aldC-F为上游引物，以aldC-R为下游引物，以枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis 168基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸脱羧酶的编码基因aldC和部分S2的片段aldC-1；

以引物alsS-F为上游引物，以alsS-R为下游引物，以枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis168基因组为模板，经PCR，制备含有α-乙酰乳酸合成酶的编码基因alsS和另外部分S2的片段alsS-1；

以引物aldC-F为上游引物，以alsS-R为下游引物，利用片段aldC-1和alsS-1，制备融合片段aldC-S2-alsS；

3)以引物aldC-F为上游引物，以NOX-R为下游引物，利用片段ldh-nox和aldC-S2-alsS，经PCR，制备融合片段aldC-S2-alsS-ldh-nox；

将融合片段aldC-S2-alsS-ldh-nox与pET28a通过NheI/XhoI双酶切，经连接、转化后得到质粒pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox；将质粒pET28a-aldC-S2-alsS-ldh-nox导入突变型大肠杆菌BL-2中得到产乙偶姻大肠杆菌工程菌BL-3；

所述pET28a-ldh的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示；

所述pET28a-nox的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示；

所述引物LDH-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.38所示；

所述引物LDH-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.39所示；

所述引物NOX-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.40所示；

所述引物NOX-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.41所示；

所述引物aldC-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.42所示；

所述引物aldC-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.43所示；

所述引物alsS-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.44所示；

所述引物alsS-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.45所示。