[发明专利]基于CRISPR-Cas系统构建GSTZ1基因敲除细胞系的方法及其应用

权利要求书

1.一种靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA，其特征在于，所述sgRNA由sgRNA-F和sgRNA-R组成，sgRNA-F的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，sgRNA-R的核苷酸序列如SEQ IDNO:2所示。

2.一种CRISPR/Cas慢病毒载体，其特征在于，包含如权利要求1所述的靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA。

3.如权利要求2所述的CRISPR/Cas慢病毒载体，其特征在于，所述CRISPR/Cas慢病毒载体由慢病毒载体lentilCRISPR v2经Esp3I酶切后，连入带Esp3I粘性末端的权利要求1所述的靶向人正常肝细胞GSTZ1基因的sgRNA重组得到。

4.一种慢病毒，其特征在于，含有权利要求2或3所述的CRISPR/Cas慢病毒载体。

5.一种基于CRISPR-Cas系统构建人正常肝细胞GSTZ1基因敲除细胞系的方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)在权利要求1所述的sgRNA-F的5’端加上CACC得到正向寡核苷酸，在权利要求1所述的sgRNA-R的5’端加上AAAC得到反向寡核苷酸，分别合成正向寡核苷酸和反向寡核苷酸，将正向寡核苷酸和反向寡核苷酸变性、退火，形成双链DNA片段；

2)将步骤1)得到的双链DNA片段与Cas载体连接，得到重组表达载体；

3)将步骤2)得到的重组表达载体与包装系统共转染包装细胞，收获病毒后纯化、浓缩，得到病毒颗粒；

4)将步骤3)制得的病毒颗粒感染细胞，筛选稳定转染的细胞，得到成功敲除GSTZ1基因的细胞系。

6.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤2)中Cas载体为慢病毒载体lentilCRISPR v2。

7.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中包装细胞为293T细胞。

8.如权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤3)中病毒颗粒包括如权利要求1所述的sgRNA。

9.如权利要求5～8任一项所述的方法制备的敲除GSTZ1基因的细胞系。

10.如权利要求9所述的细胞系在肝细胞增殖检测中的应用。